實驗概要
本實驗運用雙向電泳技術、計算機圖像分析與大規模數據處理技術以及質譜技術研究了。鈣調素調節的下游效應蛋白的表達模式和活性，通過鑒定這些蛋白、分析它們的表達模式以及它們依賴于Ca2 的與CaM的相互作用，將有助于我們了解鈣-鈣調素信號在時間和空間上的特異性，初步探討了細胞如何通過鈣-鈣調素信號響應不同生物/非生物刺激而引發下游一系列不同的復雜細胞學事件，從而進一步加深我們對于細胞極性生長調節機理的了解。
主要設備
IPGphor II等電聚焦系統(Amersham Biosciences，Sweden)
ZipTip C18柱(Millipore，MA，USA)
電噴霧離子化四級桿飛行時間串聯質譜(ESI-Q TOF-MS/MS，Micromass，UK)
實驗材料
白杄花粉
實驗步驟
1. 材料培養
白杄花粉懸浮于以下三種培養基，25℃條件下振蕩(120 rpm)暗培養。
1) 12%蔗糖 0.01% H3BO3 0.03% Ca(NO3)2 (CKM)
2) 12%蔗糖 0.01% H3BO3 0.03% Ca(NO3)2 25 μM TFP
3) 12%蔗糖 0.01% H3BO3 0.03% Ca(NO3)2 50 μM TFP
2. 花粉總蛋白的提取
收集培養20 h的白杄花粉，液氮研磨，將粉末懸浮于12.5%三氯乙酸溶液中(丙酮配制，含0.07%巰基乙醇)，于-20℃放置兩小時。15000 rpm 4℃離心10 min，棄除上清液，重懸于三倍體積的冷丙酮中(含0.07%巰基乙醇)，-20℃過夜。15000 rpm 4℃離心，棄除上清液，沉淀重懸于80%丙酮中(含0.07%巰基乙醇)，-20℃放置1 h。離心棄除上清液，待丙酮揮發完后，用裂解液溶解(7 M urea，2 M thiorea， 4% (w/v)CHAPS，2%(V/V) ampholine pH 3.5-10，1% DTT，50 μg/mL PMSF)，之后離心取上清，通過上述過程提取出來的蛋白質，用Bradford法測定濃度(DU 640 Spectrophotometer，Beckman，USA)。
3. 雙向電泳和圖像分析
雙向電泳實驗主要依據《安瑪西亞雙向電泳手冊》中推薦的方法略加改進。等電聚焦之前將干膠條 (pH 3-10 L，24 cm)于450 μl再水化液(包含樣品)中水化上樣(含8 M urea，2% (w/v) CHAPS，0.5% (v/v) ampholine pH 3-10，0.002% bromophenol blue)，室溫過夜。再水化溶液中含600 μg蛋白質樣品。等電聚焦實驗使用IPGphor II等電聚焦系統。等電聚焦使用下列參數：500 V 1 h，1000 V 1 h，然后將電壓增加到8000 V，升壓模式選取“step by step”，最后總電壓伏時數為64 kVh。第二向電泳之前膠條先平衡兩次，每次分別15 min，第一次平衡液為：50 mM Tris-HCl (pH 8.8)，6 M urea，30% glycerol，2% SDS，0.002% bromophenol blue， 1% DTT；第二次平衡液：50 mM Tris-HCl (pH 8.8)，6 M urea，30% glycerol，2% SDS，0.002% bromophenol blue，2.5% idoacetamide。平衡后膠條放置在12.5%單一梯度聚丙烯酰胺凝膠上，用0.5%的瓊脂糖固定，每塊膠30 mA，電極緩沖液保持在12℃進行第二向電泳，直到指示劑到達膠底部。凝膠用0.1%考馬斯亮蘭R-250染色。
電泳后的凝膠掃描保存圖像(300 dpi)，ImageMaster 2D Platinum 5.0軟件分析(Amersham Biosciences， Sweden)，表觀分子量根據標準蛋白分子量來確定。同一處理的二維電泳至少重復3次，切取差異表達蛋白進行膠內酶解和質譜分析。
4. 膠內酶解
將蛋白質斑點從膠上切下后，用50%乙腈和25 mM NH4HCO3脫色，50 mM NH4HCO3處理在40℃下處理1 h，水洗一次，10 mM DTT，60℃還原1 h，還原后真空冷凍抽干，再用40 mM碘乙酰胺處理30 min后水洗抽干，最后用10 μl 20 ng/μl trypsin (Proteomics grade，Sigma) 37℃下暗處酶切12-16 h。肽段用0.1%三氟乙酸和50%乙腈提取，真空冷凍濃縮至10 μl左右，-80℃保存待用。
5. 質譜鑒定及數據庫檢索
膠內酶解后的樣品用ZipTip C18柱脫鹽，終體積約為2 μl。電噴霧離子化四級桿飛行時間串聯質譜測定序列。串聯質譜數據經MassLynxTM軟件處理后生成peak list文件，以此文件利用MASCOT搜索引擎(www.matrixscience.com)進行數據庫檢索，選擇NCBI non-redundant數據庫(Bermann et al.， 2000; Wheeler et al.， 2004)；對于檢索結果網站提供一個可信度分值(MOWSE Score)，如果實際值大或等于該值則錯誤率小于5%。當出現多個大于標準MOWSE Score值的時候，一般選取得分最大的結果，同時還參考其匹配的肽段序列覆蓋率(sequence coverage)以及雙向電泳膠上表觀分子量和等電點確定。全部的檢索結果經EST other數據庫檢索驗證。