二代基因測序對癌癥治療究竟是奢侈品，還是標配？

　　Bryce Olson是英特爾的一名員工，幾年前，非常突然的，Bryce被診斷出了IV期前列腺癌，腫瘤的侵襲性很強，而且已經發生了多處轉移。一開始，Bryce嘗試了手術、化療和放療，然而這些傳統療法都不能阻止腫瘤的發展。Bryce想，按照這樣發展，自己大概看不到女兒小學畢業了。

　　傳統療法的大門雖然被封了，好在，二代基因測序（Next Generation Sequencing，NGS）為他打開了一扇窗，美國FDA批準的腫瘤伴隨診斷工具FoundationOneCDx（F1 CDx）檢測的結果表明，Bryce有可以被靶向的基因突變，根據這個結果，他加入了一個靶向藥物的I期臨床試驗，這讓他平安地度過了2年的時間。

　　基因組變異檢測方法的“亂斗”

　　能和侵襲性非常強的癌癥搏斗多年，新癌癥療法（靶向和免疫治療）和基因測序的快速發展可以說是功不可沒。

　　在靶向治療領域，目前，已經有數十種藥物問世，它們靶向不同的基因組變異，包括點突變（堿基替換、插入或缺失），拷貝數變異以及DNA重排，檢測出這些變異是進行靶向治療的第一步，也是靶向治療的基礎。

　　那么問題來了，如何檢測變異呢？

　　其實方法很多，傳統方法包括擴增阻礙突變系統（ARMS）、熒光原位雜交（FISH）、免疫組化（IHC）和逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）。雖然是“老資格”，技術成熟，但是這些方法都各有利弊。例如，ARMS檢測的敏感性很高，但它僅能用于檢測已知的堿基替換、插入或缺失。FISH和IHC均可以用于檢測DNA重排、擴增和融合突變，但難以對融合突變進行區分[1]。這就意味著，在實際應用中，只使用單一的檢測方法可能會導致患者的變異無法被檢測到。

FISH檢測基因融合結果的示意圖，黃色箭頭所指即為融合的基因

　　事實也確實如此，根據一些臨床試驗的數據，在肺癌中，有大約35%的ALK基因重排無法通過FISH檢測到，而在乳腺癌中，有大約15%的HER2擴增無法通過FISH和IHC檢測到。

　　隨著NGS與臨床的結合，似乎又給科學家、腫瘤臨床醫生與病人帶來了抗擊癌癥新的武器。NGS可以一次性的對所有基因或是特定基因進行檢測，這是上述的傳統方法無法在單次檢測中完成的。

　　不過NGS只是一個技術，如何利用它為癌癥患者服務呢？一般情況下，根據不同的癌種，患者可以接受特定的幾個或幾十個基因的測序。以非小細胞肺癌為例，檢測的基因通常包括EGFR、ALK和ROS1，根據突變的類型不同也有不同的靶向藥物使用。

　　除了這三個基因外，在條件允許的情況下，也可以對BRAF、MET、HER2、KRAS和RET這幾個基因進行檢測。

　　但此前最經濟實用的做法基本上是集中在“熱點序列”上，對這些特定的基因變異進行檢測。這就如同雪夜的路燈一樣，我們只能看到燈光下過往的汽車，而燈光以外的世界有什么？一片漆黑。其結果顯而易見，這樣的檢測會讓一些患者會出現“假陰性”。

　　在2016年的一項研究中，研究人員對250例EGFR外顯子19缺失突變的非小細胞肺癌患者腫瘤樣本進行了全面基因組測序（CGP），發現有71例患者有可靶向的缺失突變，但是這其中有12例在之前的診斷中為陰性[2]，也就是說，有17%的患者的EGFR外顯子19的缺失突變被遺漏了！

　　如果沒有CGP的話，那么這些患者的恐怕就沒有機會接受EGFR酪氨酸激酶抑制劑（EGFR TKI）的治療了。

　　全面基因組測序與抗腫瘤新時代的左膀——靶向治療

　　說起CGP，那就不得不提2017年獲得FDA上市批準的F1 CDx，它是首個獲批的可以應用于多種實體瘤伴隨診斷的CGP產品。F1 CDx是由一家美國的初創企業Foundation One研發的產品，這家公司在起步階段獲得了大名鼎鼎的喬布斯，蓋茨基金會，以及谷歌的投資，最近又為腫瘤領域的巨搫瑞士羅氏集團收歸旗下。

　　與普通的CGP不同的是，F1 CDx完全聚焦在目前已知的與腫瘤相關的基因上，獲批時，F1 CDx檢測的腫瘤驅動基因數目為324個。這與人類的所有的基因相比雖然滄海一粟，但優勢也是十分明顯：第一，與全外顯子組測序相比，經濟實惠；第二，檢測效率高；第三，檢測結果可以直接運用到腫瘤臨床治療中。

　　F1 CDx的測序結果是一份詳盡的報告，并會發送給醫學專家進行分析，根據可靶向的靶點為患者提供已經獲批的藥物治療方案，以及目前FDA已經批準的臨床試驗中患者有機會可以參加的臨床試驗，就像開頭提到的Bryce一樣。

F1 CDx的檢測報告示例圖

　　給大家舉個栗子，在巴西圣保羅，一名51歲的男子在腸鏡檢查中發現了直腸惡性腫瘤，而且已經轉移到了肝臟和肺部，在直腸切除和化療后，患者的病情得到了部分緩解，接著，他又通過手術切除了轉移的腫瘤。然而，5個月后，在他的肝臟和肺部，醫生發現了新的腫瘤灶以及腦和多個淋巴結的轉移。

　　為了控制病情，他又接受了放療和兩次手術，術后繼續用化療和抑制腫瘤血管生成的貝伐單抗進行治療，這一次，病情的穩定維持了6個月。6個月之后，腫瘤再次來襲，此時，這名男子已經出現了惡病質和肝性腦病，束手無策的醫生這時候想到了F1 CDx。通過F1 CDx測序后，醫生找到了6種基因變異，其中包括FLT3的擴增，它是急性髓系白血病中最為常見的突變。

　　基于這個靶點，這名男子開始服用索拉非尼，在治療后7天內，他的肝性腦病迅速改善。30天后，總膽紅素水平從11mg/dl降至正常水平。不過可惜的是，4個月后，他的腫瘤再次出現進展，很快就因為直腸癌導致的肝功能不全而去世了[3]。如果能夠更早期進行F1 CDx的檢測，這名男子的結局可能會完全不同。

　　抗腫瘤新時代的右臂——免疫治療

　　除了324個腫瘤驅動基因外，F1 CDx獲批上市的時候還“夾帶”了2個可以預測免疫檢查點抑制劑療效的分子標記：微衛星不穩定（MSI）和腫瘤突變負擔（TMB）。

　　為什么說這兩個分子標記非常重要呢？這就要從現在最熱門的腫瘤免疫治療說起了。無論是O藥，K藥，還是T藥，雖然針對特定人群的疾病緩解都比過去有顯著提高，但在總體人群中的響應率仍然只有20%到30%。面對如此昂貴的藥物，患者如何知道自己的腫瘤是否能夠對它有響應呢？

　　這時候就需要“求助”MSI或者是TMB了。首先來說MSI，在細胞中，DNA錯配修復路徑缺陷（dMMR）會導致基因組不穩定，致使突變積累或出現MSI。從2013年開始，就有研究人員發現，PD-1抗體對攜帶dMMR的癌癥患者可能更有效[4]，后來的臨床試驗也證明了這一點[5]，dMMR成為了PD-1抗體療效預測的指標。

　　但是，dMMR在不同癌種中攜帶者的比例大不相同，且大部分癌種中比例都不高。所以，想要更多的患者能夠獲益，還需要其他更有代表性的標志物，于是，TMB出現了。從這個名字中我們也能猜到，TMB越高，患者或許就能從免疫治療中獲益越多。

　　2015年和2016年，兩項臨床研究驗證了這個觀點[6,7]，奠定了TMB在預測免疫治療效果中的地位。基于這些研究成果，今年，TMB被寫入了非小細胞肺癌的NCCN指南中，作為衡量患者是否可以接受免疫治療的推薦檢測方法，另外，使用經過驗證的NGS panel檢測MSI/dMMR以及其他幾個常見基因變異也被更新進了NCCN指南。

　　不過，檢測TMB所用的全外顯子組測序技術成本可是相當之高，這完全限制了TMB在實際臨床中的應用。

　　F1 CDx恰好解決了這個問題，它分析數百個癌癥相關基因的總計約1.1Mb大小的外顯子序列，然后計算TMB水平，多個研究表明，它的一致性高[8-10]，與全外顯子組測序一樣準確[11]。當然，成本可比全外顯子組測序要低多了。

　　助攻抗腫瘤新希望的誕生

　　除了幫助患者發現治療靶點，鏈接到治療方案外，基因測序技術在新藥的研發和藥物適應癥的擴大研究中也發揮著重要的作用。

　　幾年前，美國范德比爾特大學醫學中心接收了一名患有IV期肺癌的33歲男性，他沒有任何已知的可以被靶向的基因變異，然而，F1 CDx的檢測結果顯示，這名患者具有EGFR激酶結構域重復（EGFR-KDD），這種變異還從來沒有在肺癌中被發現過。體外培養的細胞實驗表明，EGFR-KDD確實是一種驅動腫瘤生長的變異，在幾種EGFR TKI中，阿法替尼抑制癌細胞生長的效果最為明顯。

　　由于患者已經對標準的一線化療出現抵抗了，研究人員只能嘗試使用阿法替尼對他進行治療。很快，患者的病情就得到了緩解，2個周期的治療后，腫瘤縮小了約50%！然而不幸的是，7個周期的治療后，患者對阿法替尼產生了耐藥[12]，但卻給EGFR肺癌藥物的研發打開了一個新思路。

患者在阿法替尼使用前（左）、使用2個周期（中）和使用7個周期（右）后的腫瘤（紅色箭頭所指）直徑（cm）變化：6.62 vs. 2.72 vs. 6.20

　　不知道大家最近有沒有關注到前些天被刷屏的“有效率75%的重磅神藥Larotrectinib”，當然了，這個“有效率75%”是個錯誤解讀，應該是“在臨床試驗中，患者的總體緩解率（ORR）為75%”。Larotrectinib是一款廣譜抗癌藥物，靶向NTRK基因融合，覆蓋17種癌癥，但實際上，NTRK基因融合是一種非常罕見的基因突變，在美國，預計只有2500-3000名患者[13]，在中國，它的突變率大約為0.3%[14]，按這個比例，患者也只有30000人左右。

　　雖然適用人群窄，但是NTRK基因融合是最早被鑒定出來的腫瘤驅動基因之一，目前，只有基于NGS的檢測方法才能高敏感性和高特異性的檢測出NTRK基因融合，傳統方法中，IHC和RT-PCR對此完全是“心有余而力不足”，FISH倒是可以，但因為NTRK家族包含3個基因[15]，所以它需要進行多次檢測，而且還要求高度專業化的病理學分析才可以[16-19]。

　　如果無法準確地檢測出突變的話，那么臨床試驗的進行毫無疑問會受到阻礙，更不用說正式上市，真正的應用到大多數患者中了。

　　除了Larotrectinib外，針對NTRK基因融合，羅氏也聯合Foudnation Medicine正在開展一項臨床研究，不過不同的是，Entrectinib不但針對跨腫瘤的NTRK基因融合的患者，還同時針對ROS1基因融合，今年10月ESMO期間最新發布的數據顯示，包括至少19種病理學腫瘤類型（按腫瘤部位的常規分類是10種類型）對Entrectinib治療有應答[20]。

不同類型的癌癥患者腫瘤長徑總和（SLD）的最優變化（%）

　　Entrectinib的“廣譜”抗癌特性有可能重新定義癌癥患者個體化治療，已被美國FDA授予突破性療法（BTD）認定。與此同時，NGS也被視為患者接受不定型腫瘤（tumor agnostic）治療的必要條件。

　　有能夠被靶向的靶點和檢測方法，才會有新藥物的成功研發和上市，這一點，也是正在經歷癌癥復發的Bryce的愿景，是的，在平安度過了2年后，Bryce對服用的靶向藥物耐藥了，檢查結果顯示，他的腫瘤又開始聞風而動了。

　　而Bryce依然沒有放棄，他尋求到了Broad研究所和其他一些癌癥研究領域研究人員的合作，利用人工智能技術在大量的基因測序數據中進行篩選和分析，希望能夠從中發現新的靶點和藥物。

　　現在一邊工作一邊積極治療的Bryce還積極參加到患者倡導運動中來，無論到哪里，他總會穿著一件黑色T恤，上面印有兩個英文單詞：“Sequencing Me”，NGS將他從死神的手上奪了回來，他希望所有的癌癥患者都明白，在今天這個時代，接受NGS不應該是只屬于少數患者的奢侈品，而是一件必需品。他也渴望自己和向他一樣的數百萬患者能夠受益于NGS以及隨之而來的新的治療方法。

　　參考資料：

　　[1] Su D, Zhang D, Chen K, et al. High performance of targeted next generation sequencing on variance detection in clinical tumor specimens in comparison with current conventional methods[J]. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research, 2017, 36(1): 121.

　　[2] Schrock A B, Frampton G M, Herndon D, et al. Comprehensive genomic profiling identifies frequent drug sensitive EGFR exon 19 deletions in NSCLC not identified by prior molecular testing[J]. Clinical Cancer Research, 2016: clincanres. 1668.2015.

　　[3] Moreira R B, de Sousa Cruz M R. Clinical response to sorafenib in a patient with metastatic colorectal cancer and FLT3 amplification[J]. Case reports in oncology, 2015, 8(1): 83-87.[4] Lipson E J, Sharfman W H, Drake C G, et al. Durable cancer regression off-treatment and effective reinduction therapy with an anti-PD-1 antibody[J]. Clinical Cancer Research, 2013, 19(2): 462-468.

　　[5] Le D T, Uram J N, Wang H, et al. PD-1 blockade in tumors with mismatch-repair deficiency[J]. New England Journal of Medicine, 2015, 372(26): 2509-2520.

　　[6] Rizvi N A, Hellmann M D, Snyder A, et al. Mutational landscape determines sensitivity to PD-1 blockade in non–small cell lung cancer[J]. Science, 2015, 348(6230): 124-128.[7] http://www.ascopost.com/News/43820

　　[8] Campesato L F, Barrososousa R, Jimenez L, et al. Comprehensive cancer-gene panels can be used to estimate mutational load and predict clinical benefit to PD-1 blockade in clinical practice[J]. Oncotarget, 2015, 6(33): 34221-34227.

　　[9] Johnson D B, Frampton G M, Rioth M J, et al. Targeted Next Generation Sequencing Identifies Markers of Response to PD-1 Blockade[J]. Cancer immunology research, 2016, 4(11): 959-967.

　　[10] Rizvi H, Sanchez-Vega F, La K, et al. Molecular determinants of response to anti–programmed cell death (PD)-1 and anti–programmed death-ligand 1 (PD-L1) blockade in patients with non–small-cell lung cancer profiled with targeted next-generation sequencing[J]. Journal of Clinical Oncology, 2018, 36(7): 633.

　　[11] Chalmers Z R, Connelly C F, Fabrizio D, et al. Analysis of 100,000 human cancer genomes reveals the landscape of tumor mutational burden[J]. Genome Medicine, 2017, 9(1).

　　[12] Gallant J N, Sheehan J H, Shaver T M, et al. EGFR kinase domain duplication (EGFR-KDD) is a novel oncogenic driver in lung cancer that is clinically responsive to afatinib[J]. Cancer discovery, 2015: CD-15-0654.

　　[13] http://www.evaluate.com/vantage/articles/news/pricing/bayer-wants-top-dollar-larotrectinib

　　[14] https://oncologypro.esmo.org/Meeting-Resources/ESMO-2018-Congress/The-landscape-of-NTRK-fusions-in-Chinese-solid-tumor-patients

　　[15] Bourgeois J M, Knezevich S R, Mathers J A, et al. Molecular detection of the ETV6-NTRK3 gene fusion differentiates congenital fibrosarcoma from other childhood spindle cell tumors[J]. The American journal of surgical pathology, 2000, 24(7): 937-946.

　　[16] Abel H J, Al-Kateb H, Cottrell C E, et al. Detection of gene rearrangements in targeted clinical next-generation sequencing[J]. The Journal of Molecular Diagnostics, 2014, 16(4): 405-417.

　　[17] Rogers T M, Arnau G M, Ryland G L, et al. Multiplexed transcriptome analysis to detect ALK, ROS1 and RET rearrangements in lung cancer[J]. Scientific reports, 2017, 7: 42259.

　　[18] Abel H J, Duncavage E J. Detection of structural DNA variation from next generation sequencing data: a review of informatic approaches[J]. Cancer genetics, 2013, 206(12): 432-440.[19] Amatu A, Sartore-Bianchi A, Siena S. NTRK gene fusions as novel targets of cancer therapy across multiple tumour types[J]. ESMO open, 2016, 1(2): e000023.

　　[20] https://www.esmo.org/Oncology-News/Entrectinib-NTRK-Fusion-Positive-Tumours-Demetri