一、通過鹽柚提從用紫杉醇穩定的微管中分離微管相關蛋白
1. 得到沉降下來的經紫杉醇穩定了的微管。或者可以通過加紫杉醇到 20 μmol/L 來穩定用組裝/解聚方法制備的微管。
2. 于 37℃ 在微管中加 NaCl 使終濃度為 0.35 mol/L。
3. 37℃ 在溶液下面鋪幾毫升含 10% 蔗糖和 10 μmol/L 紫杉醇的 PME 緩沖液，立即在 25℃ 以 45000 g 離心 30 分鐘。
4. 含 20 μmol/L 紫杉醇的 PME 緩沖液重懸微管，然后分裝成小份（50 μl）在液氮中冷凍并貯存于 -80℃ 以備后用。
5. 通過透析或凝膠滲透層析給微管相關蛋白脫鹽，然后如步驟 4 貯存。
二、用磷酸纖維素進行離子交換層析來純化微管蛋白并去掉微管相關蛋白
準備磷酸纖維素柱
1. 磷酸纖維素懸浮在 0.5 mol/L KOH 或 NaOH 中，比例是每克磷酸纖維素用 15 ml 堿，至少 30 分鐘，最多 2 小時。
2. 用 Buchmer 漏斗加上濾紙（Whatman # 1 ) 真空抽濾磷酸纖維素，用蒸餾水洗滌，直到流出液的 pH 值大于 8.0。
3. 拿洗瓶用水把沉降在漏斗上的磷酸纖維素沖下來，在 0.5 mol/L HCl（每克磷酸纖維素用 15 ml HCl）中輕輕地重懸磷酸纖維素，讓磷酸纖維素沉降 30 分鐘。
4. 去掉上清，用新鮮的 0.5 mol/L HCl ( 15 ml/g ) 輕輕地重懸磷酸纖維素，再沉降 30 分鐘。
5. 用 Buchner 漏斗加上濾紙（Whatman#1）真空抽濾磷酸纖維素，用蒸餾水洗滌，直到流出液的 pH 值大于 5.0。
6. 拿洗瓶用水把沉降在漏斗上的磷酸纖維素沖下來，用柱緩沖液（CB ) 輕較地重懸磷酸纖維素。
柱緩沖液（CB )：
50 mmol/L PIPES，pH 6.9
2 mmol/L EGTA
1 mmol/L MgSO4
1 mmol/L DTT( 或 DTE)
0.1 mmol/L GTP
7. 小心地用合適的堿滴定磷酸纖維素混和物使 pH 為 6.9，使用前貯存在 4℃。
8. 把磷酸纖維素混和物倒到適當大小（即 0.9 cm x 30cm ) 的柱子中，用柱緩沖液洗柱子，直到流出液的 pH 和離子強度和柱緩沖液的相同。
上樣和跑柱子
9. 把組裝/解聚的方法純化得到的微管重懸在柱緩沖液中，在 4℃ 冷浴 30 分鐘，然后離心使變澄清。
10. 每毫升柱床體積 1~3 mg 蛋白質的比例把含微管蛋白一聚體和微管相關蛋白的上清加到已平衡了的磷酸纖維素柱子上。
11. 用柱緩沖液以每分鐘 0.5 ml 的速度洗柱子，以每管 1~2 ml 進行分部收集，在 280 nm 檢測流出液的吸收值。
12. 在洗脫后，立即在含微管蛋白的收集液中加一定體積的濃縮貯存液，使 MgSO4 濃度為 1 mmol/L。
13. 管蛋白峰洗脫下來后，洗脫緩沖液改換成含 0.8 mol/L 鹽的柱緩沖液（KCl 或 NaCl，取決于調節柱緩沖液中 PIPES 組分 pH 時所用的是哪種堿 )。
14. SDS-PACE 檢測每個峰的純度和組成。 展開 | 