從石蠟包埋固定的組織中制備RNA實驗

石蠟包埋的組織樣品

甲酰胺消化緩沖液乙醇肝糖異丙醇苯酚氯仿蛋白酶 KTrizol二甲苯

微量離心管恒溫箱

一、材料

1. 緩沖液、溶液和試劑

去離子化的甲酰胺

焦碳酸二乙酯（DEPC) 處理過的水

消化緩沖液（lmol/L 異硫氰酸胍,25 mmol/Lβ-巰基乙醇，0.5%N-月桂酰肌氨酸，20 mmol/LTris-HCl，pH7.5)

乙醇,100% 和 70%

肝糖

異丙醇

苯酚 (pH4.3): 氯仿（70%:30%)

蛋白酶 K(60 mg/ml，20U/mg)

Trizol(Invitrogen)

二甲苯

2. 特殊設備

微量離心管，2 ml, 無 RNA 酶

恒溫箱，預調至 37°C

水浴或恒溫箱，預調至 55°C

3. 細胞和組織

石蠟包埋的組織樣品，切割為 5~50 張 5um 厚的切片

二、方法

1. 將組織塊置于 2.0 ml 微量離心管中，向樣品中加 1.8 ml 二甲苯。37°C 溫育 20 min。

2. 稍微地離心樣品，移棄上清液再加入二甲苯，重復溫育和離心步驟。

3. 用 0.5 ml 乙酵洗滌組織。移棄乙醇，風干。

4. 加 80ul 蛋白酶 K(60 mg/ml，20U/mg) 和 72ul 消化緩沖液。55°C 下振蕩溫育過夜。

5. 再次加 80ul 蛋白酶 K，55°C 下振蕩溫育過夜。次日再次加 80ul 蛋白酶 K, 再次 55°C下振蕩溫育過夜。

6. 加等體積酚：氯仿，混合，在微量離心機中以最大轉速離心 5 min。將液相轉移到RNA 酶的新管中。

7. 加等體積異丙醇和 2ug 肝糖，-20°C 放置 30 min。

8. 在微董離心機中以最大轉速離心 30 min。移棄上清液，用 70% 乙酵洗滌沉降物。

9. 在微量離心機中以最大轉速離心 30 min 并移棄上清液。風干沉降物，將之再溶解20ulDEPC 處理過的水中。加 500ulTrizol。遵循 Trizol 方案（見本章方案 3)，對一處做修改：在第一次 Trizol 處理后，將液相轉移到無 RNA 酶的新管中，用 500ulTrizol 第二次處理樣品。

10. 向第二次 Trizol 處理過的液相加 500ul 異丙醇以沉淀 RNA。

11. 將 RNA 沉降物再溶解于 20ul 去離子甲酰胺中。-20°C 儲存 RNA。