實驗概要
本實驗介紹了免疫電泳(immunoelectrophoresis，IE)實驗原理及操作流程。蛋白質是一種兩性電解質，它同時具有游離氨基和羧基。每種蛋白質都有自己的等電點。在等電點時，蛋白質所帶的正負電荷相等。在pH值大于等電點的溶液中，羧基解離多，此時蛋白質帶負電荷，帶負電荷的蛋白質在電場中向正極移動；在pH值小于等電點的溶液中，氨基解離多，此時蛋白質帶正電荷，在電場中向負極移動。這種帶電質點在電場中向正極或負極移動，就稱為電泳。各種免疫電泳技術也都是基于這一原理設計而成的。
實驗原理
免疫電泳是指利用凝膠電泳，結合免疫擴散，以提高對混合組分分辨率的一種免疫化學分析技術。相應的抗原、抗體相遇后，比例恰當時，即出沉淀線。由于樣品的游動圖型呈放射狀向外擴散，相應血清呈直線狀擴散，于是二者相遇形成的沉淀線呈弧狀。該方法可用來研究：抗原和抗體的相對應性；測定樣品的各成分以及它們的電泳遷移率；根據蛋白質的電泳遷移率、免疫特異性及其他特性，可以確定該復合物中含有某種蛋白質；鑒定抗原或抗體的純度。
主要試劑
1. 電泳緩沖液：常用pH值8.6、離子強度為0.075mol/L的巴比妥緩沖液。
其配法如下：
巴比妥27.6 g
巴比妥鈉 15.45 g
蒸餾水加至1 000 ml
先將巴比妥放于已盛有300ml蒸餾水的三角燒瓶中加熱熔化，再加入700ml蒸鎦水，并加入巴比妥鈉，溶后即可使用。也可先將巴比妥溶于1 000ml蒸餾水中，然后再加入巴比妥。
2. 15%緩沖瓊脂：稱取瓊脂粉15g放入100ml巴比妥緩沖液中，高壓或煮沸溶化。
主要設備
1. 電泳儀：一般要求電泳儀的電壓能為0～500V，而電流從0～100mA即可。
2. 電泳槽：電泳槽宜用閉合式，防止由于電泳過程中產熱，而使其瓊脂凝膠中水份過度蒸發。作為電泳板的白金絲，必須與電泳槽等長，而槽中的緩沖液必須充分蓋過電極，量要足夠。
實驗步驟
1. 取玻片一張，做好標記，然后按下圖式樣放上細玻璃棒(70×2mm)1根；
2. 把已溶化的15%巴比妥緩沖瓊脂澆注在玻片上，每張25ml～30ml。注意勿使玻棒全部埋入瓊脂中，應露1/3，澆注時不要使玻棒移動；
3. 打孔加樣，孔徑1～2mm，孔離玻棒不宜太遠或太近，以4mm為宜，用毛細滴管把抗原滴入孔中，然后進行電泳；
4. 電泳，把瓊脂板放入電泳槽的支架上，兩端分別貼上用2～4層已浸透緩沖液的濾紙或濾布，同槽內的緩沖液架橋相連。濾紙的寬度要同瓊脂板的寬度一致，不宜過窄或過寬。加樣的端接負極，另一端接正極。電壓按玻片長度3～6V/cm為準(也可按電流計算，即玻片寬度2～4mA/cm)，一塊26×76cm的玻片，用42～45V的端電壓，端電壓是用萬用電表測量瓊脂板兩端所得的實際工作電表壓，并不是電泳儀表指針所示的電壓。電泳時間為1～2h；
5. 加入抗體，電泳完畢，用柳葉刀沿玻璃棒兩側劃開瓊脂，取出玻棒(用小鑷子取出)，即成為抗體槽，用毛細管滴加抗體，注意勿使抗體溢出；
6. 加畢抗體后，將瓊脂板放入有蓋浸有濕紗布的搪瓷盤中，置37℃恒溫箱中擴散24h之后，取出，觀察結果；
7. 染色，將瓊脂板放生理水中浸泡24h，中間換液數次，取出后，用0.05%氨基黑10B染色5～10min，然后以1mol/L冰醋酸脫色至背景無色為止；
8. 保存標本的染色方法，取出瓊脂板，浸泡于生理鹽水中1～2天，以除去未起反應的蛋白質，再放置蒸餾水中脫鹽4～5h，放固定液(60%酒精98ml、冰醋酸2ml)中2h，然后用綢布或濾紙打濕后，覆蓋于瓊脂板上，置37℃ 24h干燥后，再以蒸餾水打濕綢布，揭去。再放在氨基黑10B染色液(氨基黑10B 0.5g，1mol/L醋酸500ml、0.1mol/L醋酸鈉500ml)或偶氮胭脂紅染色液中染色10～30min，取出以5%～10%冰醋酸脫色，至背景無色為止，用水沖幾次，吸干水分，保存備用。
注意事項
1. 免疫電泳法較他它電泳的優點在于具有特異性沉淀弧，即使電泳遷移率相同的組分也能檢出，因此抗原數目可用獨立弧來斷定，缺點是免疫血清不能包括所有組分的抗體，其實這也是免疫化學方法的共性。
2. 在加入抗原時，為了觀察方便起見，可于樣品中加一滴電泳指示劑(聚蔗糖0.25ml，巴比妥緩沖液10ml，偶氮胭脂紅0.05g)，這樣便于隨時掌握電泳的位置而決定結束電泳的時間。
3. 在觀察免疫電泳結果時要注意，有些沉淀出現較早，消失很快。
4. 由于瓊脂的質量與規格不同，將影響標定各抗原的位置。為此，最好用標準抗原或國際通用瓊脂定位，作為鑒定時的參考指標。