免疫組化實驗原理和步驟（五）

（6）結果判斷

免疫組化的結果判斷有兩種方法：

一是對以檢測結果陽性細胞指數來定性(如核抗原的標記)，判斷方法是以一個規野中陽性細胞數不總細胞癿百分比，再取10個相同視野算取平均指數。

另一種方法以染色陽性強度和陽性檢出率相結合而定，一般陽性細胞數在0-25為陰性，25-50為十，50-75為十十，75以上為十十十。此種判定方法容易出現人為誤差現象。有條件的實驗室最好能用圖像分析系統進行結果檢測定量分析更為準確。一切的判定方法都是力求使免疫組化染色結果判斷更標準，但各單位采取的標準不盡相同，所以判斷標準化問題還有待長期實踐中病理學術界商討判定標準。

IHC中常見的抗原表達模式有以下幾種：

1）細胞漿內彌漫性分布，多數胞漿型抗體的反應如此，如細胞角蛋白(cytokeratin，CK)和波形蛋白(vimentin)等；

2）細胞核周的胞漿內分布，其判別要點是細胞核的輪廓被勾畫得很清楚，如CD3多克隆抗體的染色；

3）胞漿內局限性點狀陽性，如CDl5抗體的染色；

4）細胞膜線性陽性，大多數淋巴細胞標記的染色如此，如CD20、CD45RO；

5）細胞核陽性，如Ki-67及雌、孕激素受體蛋白ER、PR等。一種抗體可同時出現。

 細胞漿和細胞膜的陽性表達，如EMA可呈膜性和胞漿內彌漫性陽性反應；CD30抗體可同時呈膜性和胞漿內點狀陽性反應等。

（7）對照片癿設置

免疫組化的質量取決于正確使用各種對照，沒有對照的免疫組化結果是毫無意義的。對照包括陰性對照、陽性對照和自身對照。在實踐中可用染色組織切片中不含抗原的組織作為陰性對照，而用含抗原的正常組織作陽性對照，這種自我對照具有節約的意義。觀察染色結果時，先觀察對照組織的結果，如陽性對照組織中陽性細胞呈強陽性，陰性對照細胞呈陰性，內源酶陰性，背景無非特異性染色時，表明本次實驗的全部試劑和全過程技術操作準確無誤，待檢組織中的陽性細胞也就是可信的正確結果。 免疫組化染色中對照片的設置非常重要，它是判斷您的染色是否成功的關鍵依據，而且也是檢測每一個抗體的質量標準，常設的對照如下，一般實驗最常用的只選第二種方法。

1）空白對照(陰性對照) 第一抗體由PBS或非免疫血清取代。

2）陽性對照 用已知含有要檢測抗原的切片作陽性對照。

3）回收實驗陰性對照 已知抗原不相應的第一抗體混合，發生結合沉淀，再用此沉淀抗體復合物進行免疫組化實驗，結果為陰性。

4）替代對照 用于第一抗體同種動物的血清或無關抗體代替第一抗體結果為陰性。

5）自身對照 在同一切片上，應將不同組織成分中的陽性戒陰性結果不檢測的目的物對照比較。如actin、CD34在正常組織中的血管壁肌層應為陽性，vimentin可以間質細胞，對照desmin以血管壁及肌束為對照，S-100蛋白以小神經末梢為對照等，如果應為陽性飛組織是陽性，則免疫組化技術正確，如為陰性，則表明染色技術有問題或免疫試劑質量有問題。

免疫組化染色

一．石蠟切片免疫組化染色實驗步驟：

1．石蠟切片脫蠟至水：（石蠟切片染色前應置60℃ 1小時）。

（1）二甲苯、II，各10分鐘。

（2）梯度酒精：100%，2分鐘? 95%，2分鐘? 80%，2分鐘? 70%，2分鐘。

（3）蒸餾水洗：5分鐘，2次（置于搖床）。

2．過氧化氫封閉內源性過氧化物酶：3%H2O2，室溫10分鐘（避光）。

3．蒸餾水洗：5分鐘，2次（置于搖床）。

4．抗原修復：根據待檢測的抗原，選擇適當的方法。

附：抗原修復液（10mM pH 6.0檸檬酸鈉緩沖液）的配制

（1）儲備液的配制：A液：檸檬酸三鈉-2H2O 29.41g + 蒸餾水1000ml  B液：檸檬酸21g + 蒸餾水1000ml

（2）工作液的配制：A液82ml + B液18ml + 蒸餾水900ml

抗原修復的方法：

（1）高壓鍋處理技術：檸檬酸鈉緩沖液（10mM，PH6.0）,淹沒切片,蓋上鍋蓋，高壓鍋內煮沸,上汽3分鐘后緩慢冷卻（可用自來水在高壓鍋外沖，以助冷卻）。

（2）微波處理技術：用塑料切片架，置亍塑料或耐溫玻璃容器內，檸檬酸鈉緩沖液淹沒切片，選擇中高或高檔，5分鐘；叏出并補充已預熱的檸檬酸鈉緩沖液；再選擇中高戒高檔，5分鐘。（最佳溫度為92-95℃）

（3）酶消化處理：此略抗原修復的注意事項：

1）組織不能干。

2）選擇抗原修復方法要因抗體而異。

3）該方法主要用亍10%福爾馬林固定、石蠟包埋組織。

4）抗原修復后至DAB顯色的過程中，均需用PBS緩沖液。

5、PBS：5分鐘，2次（置于搖床）。

6、正常血清封閉：從染片缸中出取切片，擦冷切片背面水分及切片正面組織

周圍的水分（保持組織呈濕潤狀態）,滴加正常山羊戒兔血清（不第二抗體同源動物血清）處理，37℃，15分鐘。

附：正常血清配制 (或按試劑盒規定的濃度配制)

按1:20比例,用PBS配制,每張切片需要量按50ml+5ml (10%拋灑量)計算。

7、滴加第一抗體：用濾紙吸去血清，不洗，直接滴加第一抗體，37℃、2小時 。

（也可置于4℃冰箱過夜）。

8、PBS：5分鐘，2次（置于搖床）。

9、滴加生物素化的二抗，37℃，40分鐘。

10、PBS：5分鐘，2次（置于搖床）。

11、滴加三抗 （SAB復合物），37℃，40分鐘。

12、PBS：5分鐘，2次（置于搖床）。

13、DAB顯色，鏡下觀察，適時終止（自來水沖終止）。

附：DAB的配制

（1）儲備液(DAB 25mg/ml)癿配制：DAB 250mg + PBS 10ml，待完全溶解后分裝成1ml,100ul,50ul，20ul等，—20℃，凍存。

（2）工作液：DAB儲備液20ul + PBS 1000ul + 3% H2O2 5ul

14．自來水（細水）充分沖洗。

15．蘇木素復染，室溫，30秒，自來水沖洗。

16．自來水沖洗返藍，15分鐘。

17．梯度酒精脫水：

80%，2分鐘 、95%，2分鐘 、100%，2次，5分鐘。

18．二甲苯透明：

I，II（二甲苯）各5分鐘。

19．封片：加拿大樹膠（或中性樹膠）封片。

二、細胞爬片的免疫疫組化染色： 1. 取出細胞爬片，迅速置入冷丙酮固定20-30分鐘。

2. 蒸餾水浸泡5分鐘，2次。

3. 打孔液浸泡5分鐘。

4. 蒸餾水浸泡5分鐘，2次。

5. 后接前述實驗步驟的第6步（正常血清封閉）。

注：第3、4步僅用于檢測細胞內抗原，檢測細胞膜抗原時不用。

三、冰凍切片的免疫組化染色：

1、新鮮組織立即在恒冷冰凍切片機內切片(也可-80℃保存),厚度為5～6mm。

2、載玻片可不打底，裱片后，立即用電吹風吹干。

3、如不馬上染色，可密封后-20℃保存。

4、染色前用冷丙酮在4℃固定10-20分鐘。

5、PBS洗2次,每次5分鐘,(必要時應用0.1%檸檬酸鈉+0.1%triton打孔)

6、3% H2O2滅活內源性過氧化物酶,20分鐘,避光；

7、用PBS洗2次,每次5分鐘；

8、接前面實驗步驟第六步。

四、載玻片的預處理：

1、洗衣粉液浸泡30分鐘，沖洗，晾干。

2、洗液 （含強酸、高錳酸鉀等）浸泡24小時，沖洗，晾干。

3、APES（1:50丙酮溶液）10-20秒（注意：不能用塑料容器及塑料切片架）。

4、純丙酮I，約10秒。純丙酮II，約5秒。

5、晾干或烤箱內烤干，備用。