1、 在雙酶切載體時如果2個酶切位點靠得很近，必須注意酶切順序。因為有的限制性內切酶要求其識別序列的兩端至少保留有若干個堿基才能保證酶的有效切割。有的酶要求識別序列兩端有多個堿基的，則必須先切，否則就可能造成酶切失敗。
2、 回收PCR產物：回收的PCR產物片段=1：10 ，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。pmol為單位的DNA轉換為為?g單位的DNA：（X
pmoles×長度bp×650）/ 1,000,000
（注：長度bp×650是該雙鏈DNA的分子量）所得數值即為?g,也可以直接用這個公式套.1pmol 1000bp
DNA=0.66μg,如載體是5380bp，則0.03pmol為0.03×5.38×0.66=0.106524?g。
3、
雙酶切時間及其體系：需要強調的是很多人建議酶切過夜，其實完全沒有必要，一般酶切3個小時，對于PCR產物，可以過夜酶切，效果會很好。酶切體系不宜過大，會影響質粒和酶的碰撞機會，效果降低；質粒量不應該超過酶切要求的最大量，否則酶切不完全，酶的用量控制在1U酶在15-20ul體系中酶解1ugDNA。
4、 兩種酶切的條件不同時，分別進行兩次酶切，切完一個純化后再切：溫度要求不同，先酶切低溫要求的，再酶切高溫要求的；若鹽濃度要求不同，先酶切低鹽濃度要求的，再酶切高鹽濃度要求的。
5、 若質粒是在TE中保存的，TE 中的EDTA可能與酶的激活因子螯合，影響酶切效果，可放大酶切體積或重新濃縮質粒。
6、 限制酶的選擇非常重要，盡量選擇粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，提前看好各公司的雙切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。選好酶切位點后，在各個酶的兩邊加上保護堿基。
7、 純化問題：純化PCR產物割膠還是柱式，推薦柱式，因為割膠手法不準，很容易割下大塊的膠，影響純化效率。現在的柱式純化號稱可以祛除引物，既然如此，酶切掉的幾個堿基肯定也會被純化掉了。所以，PCR產物和雙酶切產物的純化均可應用柱式純化。
8、
酶量的問題：以TAKARA的為例，其對1單位酶的定義如下：在50 μl 反應液中，30℃溫度下反應1小時，將1 μg
的λDNA完全分解的酶量定義為1個活性單位(U)。 而該酶濃度約為15單位/微升，在除外酶降解的
因素外，該酶可分解15μg的DNA，而一般從1-4ml菌液提出的
DNA約為3μg，而PCR純化后的產物（50體系）約為3μg，所以即便全部加進去，只要純化的 質量好，酶切完全切得動。
9、
酶切、回收后的PCR產物與載體的連接：摩爾比的計算，很多人憑經驗也可以。但對于初學者從頭認真計算則
非常有必要。回收的載體片段：回收的PCR產物片段=1：10 ，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。pmol為單位的DNA轉換為為?g單位的DNA：（X
pmoles×長度bp×650）/ 1,000,000
（注：長度bp×650是該雙鏈DNA的分子量）所得數值即為?g,也可以直接用這個公式套.1pmol 1000bp
DNA=0.66μg,如載體是5380bp，則0.03pmol為0.03×5.38×0.66=0.106524?g。
測DNA濃度可以在專用機子上測，注意OD值，一般約1.8-2.0.另外，如果嫌麻煩，也可用MARKER進行估測，如MARKER2000，5微升的 MARKER每個條帶約50ng。
10、
連接反應：TAKARA的 連接酶上的 說明寫的過夜，而其對連接酶單位的定義為：在20 μl的連接反應體系中，6 μg的λDNA-Hind
III的分解物在16℃下反應30分鐘時，有90%以上的DNA片段被連接所需要的酶量定義為1個活性單位（U）。而它的濃度為350 U/μl
，所以完全夠用。連接酶容易失活，注意低溫操作，最好在冰上。時間3個小時足已。
11、
雙酶切時如果兩種酶反應溫度一致而buffer不同時，可查閱內切酶供應商在目錄后的附錄中提供的各種酶在不同buffer中的活力表，如果有一種buffer能同時使2種酶的活力都超過70%的話，就可以用這種buffer作為反應buffer；如果兩種酶廠家不同無法查時可比較其buffer成份，相似的話可以考慮各取一半中和；任何時候2種酶的總量不能超過反應體系的1/10體積，而且最大反應體系最好不要小于20
ul。 如果2種酶的buffer成份相差較大或2種酶的反應溫度不同則必須分別做酶切。第1種酶切后要考慮用酚抽、電泳后膠回收或加熱等方法使酶失活后再進行下一次酶切反應。廠家目錄一般都會有相應的附錄以供查閱各種酶的反應溫度。有的酶可以用加熱使之失活，如CIAP；有的則不行。
12、 第一次酶切后通過電泳確證酶切完全后可以從膠中回收DNA片段再進行下次酶切，也可以在第一個酶切后直接用PCR產物回收試劑盒純化酶切樣保留少量樣品做電泳分析之用，再進行下一次酶切。還可以用一種離心純化管或叫做離心濃縮管，將酶切樣加入后離心，鹽等成份被過濾掉而核酸則被截留在柱子中間的膜上，加入適量ddH2O,離心以洗去膜上殘留的雜質，再加幾微升ddH2O在膜上，將柱子反轉插入新的eppendorf管上，離心，即可將DNA片段離下來，做下一次酶切。