蛋白質的分離純化可根據蛋白質分子的大小、電荷量、溶解度以及親和性結合部位的有無，建立許多分離純化的方法。常用的有離心分離、沉淀分離、透析法、超濾法、層析分離、膜分離以及酶法分離等。這些分離純化蛋白質的方法各有利弊。
1、離心分離
離心分離是利用不同物質之間的沉降系數或浮力密度等差異，用離心力場進行的一項分離、濃縮或提煉的物理分離分析技術。
2、沉淀分離
沉淀分離是使用最廣泛的酪蛋白組分分離技術，它主要是利用各酪蛋白組分在不同濃度溶液中的溶解性以及對溫度、離子強度以及鈣離子的敏感性差異而實現分離。根據酪蛋白組分在不同濃度尿素溶液中的溶解度差異，Hipp 等人于 1952 年首次實現了對牛乳 β-CN 和α-CN(包括 αs-CN 和 к-CN)分離，得率分別為 8 %和 45 %。Aschaffenburg等人于 1963 年結合等電點沉淀與尿素沉淀，對 Hipp 的方法進行了改進實驗，獲得了純度更高的β-酪蛋白。
3、層析分離
層析法又稱色譜法，是一種物理化學分離分析方法，是利用混合物中各組分物理化學性質差異，使各組分不同程度分布在固定相和流動相中，由于各組分受力不同從而使各組分以不同速度移動達到分離。用于酪蛋白組分純化分離的色譜技術主要有離子交換色譜，疏水層析，吸附色譜，凝膠色譜，共價色譜以及親和色譜等。Thompson 于 1966 年使用 DEAE-纖維素，用 pH=7 的含巰基乙醇和尿素的緩沖液，采用氯化鈉進行梯度洗脫，成功分離出酪蛋白組分。Bramanti 等人于 2001 年，使用苯基分離了牛奶蛋白質，蛋白樣品用 4 mol 硫氰酸胍進行處理，在 30 min 內從高鹽濃度的緩沖液(pH =7.2，含 1.8 mol 硫酸銨和 8 mol 尿素的 0.1mol 磷酸緩沖液)線性降低為低鹽濃度的緩沖液狀態(含 8 mol 尿素的磷酸緩沖液)，實現了對 as-酪蛋白，β-酪蛋白和 к-CN 的分離。
4、酶法分離
酶是一種生物催化劑，能通過改變反應的活化而加快或降低反應速度，它本身不參與反應，不改變反應的平衡點，因其具有高效性、轉移性、溫和性等特點，被廣泛應用與食品工業中。Huppertz 等人利用 β-酪蛋白和 αs-酪蛋白在低溫的酸性條件下溶解度的不同，于 2005 年使用凝乳酶實現了對 β-酪蛋白的富集分離。
5、膜分離
膜分離是根據生物膜對物質選擇性通透的原理所設計的一種對包含不同組分的混合樣品進行分離的方法。膜分離技術具有分離、純化、精制以及濃縮蛋白的功能，既高效環保又易于操作，已成為一種重要的分離技術，并廣泛應用于食品藥品、生命科學、化工冶金等重要領域，具有很高的社會效益和經濟效益。Agronomique 等人于 1986 年應用微濾技術生產了 β-酪蛋白。Akgol 于 2008 年，用聚酰胺纖維膜和活性綠-4B 染料制成親和膜，在 pH=5 條件下吸附初步純化的 β-酪蛋白，之后用含 1.0 mol 氯化鈉或含 0.5 mol 硫氰酸鈉的 Tris-HC1 緩沖溶液進行梯度洗脫，成功獲得了純度更高的 β-酪蛋白。