硫酸二甲酯遇堿迅速分解，遇水或濕氣時水解，在冷水中分解緩慢，產生硫酸氫甲酯和甲醇，隨溫度上升分解加快，在50℃時能生成硫酸二甲酯氣霧并水解為硫酸和甲醇。水解反應速率常數：1.7×10-4/s（25℃，pH=7，半衰期1.15 h） ，反應先生成硫酸一甲酯和甲醇，之后進一步水解生成硫酸，并伴有放熱。
硫酸二甲酯主要用作甲基化劑。它的甲基可以與羥基、巰基、胺基或亞胺基的酸式H原子在堿性條件下進行交換。這個反應中，硫酸二甲酯通常僅給出一個甲基。
硫酸二甲酯作為一種親電試劑處理DNA時，可以使DNA甲基化，甲基化的主要部位是G的N7和A的N3，且前者甲基化百分率為后者的四倍以上。DNA甲基化在植物生長發育過程中起著重要作用，可在不改變DNA上下離散順序的情況下，中斷遺傳信息傳遞，從而引起形態性狀變化，同時也會引起G與A脫落，導致DNA斷裂，使DNA可在甲基化位置被降解。