凝膠層析法分離蛋白質操作方法

　　本實驗通過SephadexG50層析柱，以蒸餾水為洗脫劑，分離血紅蛋白(紅色，分子量約64500)與硫酸銅(藍色，分子量249.5)的混合物，從顏色的不同可觀察到血紅蛋白洗脫快，硫酸銅洗脫較慢。

　　三．材料

　　1．儀器 層析柱(直徑0.8-1.5cm，長10-20cm)；吸管；玻璃棒；小燒杯；25ml量筒；試管。

　　2．試劑 Sephadex G-50；抗凝血； 0.9%NaCI溶液；硫酸銅溶液

　　四．方法

　　（一）凝膠的準備。由準備室制備。

　　（二）樣品制備

　　1．血紅蛋白(Hb)溶液的制備 取抗凝血液約0.5ml于離心管中，離心5分鐘(2500rpm)，棄去上層血漿，用0.9%NaCI溶液3ml洗血細胞二次，將血細胞用1.5ml蒸餾水稀釋，即為Hb稀釋液，備用。

　　3．取Hb稀釋液與CuSO4溶液各0.5ml，充分混勻，此混合液作為樣品。

　　（三）裝柱 取層析柱(直徑0.8-1.5cm，長度20cm)一支，將層析柱燒結板下端的死區用蒸餾水充滿，不得留有氣泡，然后關閉層析柱的出口。將已溶脹的凝膠懸液沿玻棒小心地徐徐灌入柱中，待底部凝膠沉積1-2cm時，再打開出口，繼續加入凝膠懸液至凝膠層積集至約15cm高度即可。凝膠懸液盡量一次加完，以免出現不均勻或分層的凝膠帶。如表層凝膠凸凹不平時，可用玻棒輕輕攪動，讓凝膠自然沉降，使表面平整。

　　（四）加樣與洗脫：加樣時先將柱的出口打開，讓蒸餾水逐漸流出，待床面上只留下極薄的一層蒸餾水時，關閉出口。用滴管將樣品(約0.4ml)小心地加到凝膠床的表面上。注意加樣時不要將床面沖起，亦不要沿柱壁加入。然后，打開出口，使樣品恰好進入床面(不要讓空氣進入床內)，用上法滴加1-2倍樣品體積的蒸餾水，待完全流進床內后，再加蒸餾水進行擴展洗脫，直至兩條區帶分開為止。

　　注意事項：洗脫的過程中，應不斷滴加蒸餾水，使始終凝膠床的上表面保留約2cm左右的蒸餾水