分子標記

內容：
一、遺傳標記 
二、DNA分子標記 
三、染色體原位雜交 
四、DNA分子標記的應用 

長期以來，植物育種中選擇都是基于植株的表型性狀進行的，當性狀的遺傳基礎較為簡單或即使較為復雜但表現加性基因遺傳效應時，表型選擇是有效的。但水稻的許多重要農藝性狀為數量性狀，如產量等；或多基因控制的質量性狀，如抗性等；或表型難以準確鑒定的性狀，如根系活力等。此時根據表型提供的對性狀遺傳潛力的度量是不確切的，因而選擇是低效的。遺傳育種家們很早就提出了利用標記進行輔助選擇以加速育種改良進程的設想。形態學標記等常規遺傳標記是最早用于植物育種輔助選擇的標記，但由于鞘可佟⒁糯榷ㄐ圓睿頁３Ｓ氬渙夾宰戳蚨檬艿膠艽笙拗啤＝昀矗腫由镅Ъ際醯姆⒄刮參鎘痔峁┝艘恢只贒NA變異的新型遺傳標記——DNA分子標記，或簡稱分子標記。與傳統應用的常規遺傳標記相比，分子標記具有許多明顯的優點，因而已被廣泛應用于現代作物遺傳育種研究的各個方面，大量以前無法進行的研究目前利用分子標記手段正蓬勃開展，并取得豐碩的成果。尤其是當分子標記技術走出實驗室與常規育種緊密結合后，正在為植物育種技術帶來一場新的變革。


一 遺傳標記 


遺傳標記（Genetic marker）指可追蹤染色體、染色體某一節段、某個基因座在家系中傳遞的任何一種遺傳特性。它具有兩個基本特征，即可遺傳性和可識別性，因此生物的任何有差異表型的基因突變型均可作為遺傳標記。遺傳標記包括形態標記（morphological marker）、細胞學標記(cytological marker)、生化標記(biochemical marker)和分子標記(molecular marker)四種類型。在植物遺傳育種研究中可被利用的遺傳標記應具備以下幾個條件：（1）多態性高；（2）表現共顯形；（3）對農藝性狀影響小；（4）經濟方便，容易觀察記載。 
形態標記即植物的外部形態特征。主要包括肉眼可見的外部特征，如：矮稈、紫鞘、卷葉等；也包括色素、生理特性、生殖特性、抗病蟲性等有關的一些特性。形態標記簡單直觀、經濟方便；但其數量在多數植物中是很有限的，且多態性較差，表現易受環境影響，并且有一些標記與不良性狀連鎖。此外形態標記的獲得需要通過誘變、分離純合的過程，周期較長。因此形態標記在作物遺傳育種中的作用是有限的。 
細胞學標記即植物細胞染色體的變異。包括染色體核型（染色體數目、結構、隨體有無、著絲粒位置等）和帶型（C帶、N帶、G帶等）的變化。與形態標記相比，細胞學標記的優點是能進行一些重要基因的染色體或染色體區域定位。但細胞學標記材料需要花費較大的人力和較長時間來培育，難度很大；同時某些物種對染色體變異反應敏感；還有些變異難以用細胞學方法進行檢測。因此到目前為止，真正應用于作物遺傳育種研究中的細胞學標記還很少。 
生化標記主要包括同工酶和等位酶標記。同工酶是指一個以上基因座位編碼的酶的不同形式，而等位酶是指由一個基因座位的不同等位基因編碼的酶的不同分子形式。分析方法是從植物組織的蛋白粗提物中通過電泳和組織化學染色法將酶的多種形式轉變成肉眼可辯的酶譜帶型。與形態標記、細胞學標記相比，生化標記具兩個方面的優點：一是表現近中性，對植物經濟性狀一般沒有大的不良影響；二是直接反映了基因產物差異，受環境影響較小。但目前可使用的生化標記數量還相當有限，且有些酶的染色方法和電泳技術有一定難度，因此其實際應用受到一定限制。 
分子標記指能反映生物個體或種群間基因組中某種差異特征的DNA片段，它直接反映基因組DNA間的差異。與上述三種標記相比較，分子標記具有許多明顯的優越性，表現為：（1）直接以DNA的形式表現，在生物體的各個組織、各個發育階段均可檢測到，不受季節、環境限制，不存在表達與否等問題；（2）數量極多，遍布整個基因組，可檢測座位幾乎無限；（3）多態性高，自然界存在許多等位變異，無須人為創造；（4）表現為中性，不影響目標性狀的表達；（5）許多標記表現為共顯性的特點，能區別純合體和雜合體。目前分子標記已廣泛用于植物分子遺傳圖譜的構建；植物遺傳多樣性分析與種質鑒定；重要農藝性狀基因定位與圖位克隆；轉基因植物鑒定；分子標記輔助育種選擇等方面。 


二 分子標記主要類型、原理與特點 


分子標記大多以電泳譜帶的形式表現，大致可分為三大類。第一類是以分子雜交為核心的分子標記技術，包括限制性片段長度多態性標記（Restriction fragment length polymorphism, 簡稱RFLP標記）、DNA指紋技術（DNA Fingerprinting）、原位雜交（in situ hybridization）等；第二類是以聚合酶鏈式反應（Polymerase chain reaction ,簡稱PCR反應）為核心的分子標記技術，包括隨機擴增多態性DNA標記（Random amplification polymorphism DNA, 簡稱RAPD標記）、簡單序列重復標記（Simple sequence repeat, 簡稱SSR標記）或簡單序列長度多態性（Simple sequence length polymorphism, 簡稱SSLP標記）、擴展片段長度多態性標記（Amplified fragment length polymorphism, 簡稱AFLP標記）、序標位（Sequence tagged sites, 簡稱STS標記）、序列特征化擴增區域（Sequence charactered amplified region, 簡稱SCAR標記）等；第三類是一些新型的分子標記，如：單核苷酸多態性（Single nuleotide polymorphism, 簡稱SNP標記）、表達序列標簽（Expressed sequences tags, 簡稱EST標記）等。以下將介紹其中最常用的一些標記技術。 
1 RFLP 
該技術由Grodzicker等于1974年創立。特定生物類型的基因組DNA經某一種限制性內切酶完全酶解后，會產生分子量不同的同源等位片段，或稱限制性等位片段。RFLP標記技術的基本原理就是通過電泳的方法分離和檢測這些片段。凡是可以引起酶解位點變異的突變，如點突變（新產生和去除酶切位點）和一段DNA的重新組織（如插入和缺失造成酶切位點間的長度發生變化）等均可導致限制性等位片段的變化，從而產生RFLP。該技術包括以下基本步驟：DNA提取；用DNA限制性內切酶消化；凝膠電泳分離限制性片段；將這些片段按原來的順序和位置轉移到易操作的濾膜上；用放射性同位素或非放射性物質標記的DNA作探針與膜上的DNA雜交（稱 Southern雜交）；放射性自顯影或酶學檢測顯示出不同材料對該探針的限制性酶切片段多態性。 
RFLP標記的主要特點有：（1）遍布于整個基因組，數量幾乎是無限的；（2）無表型效應，不受發育階段及器官特異性限制；（3）共顯性，可區分純合子和雜合子；（4）結果穩定、可靠；（5）DNA需要量大，檢測技術繁雜，難以用于大規模的育種實踐中。


2 RAPD 
由Williams等于1990年創立。其基本原理與PCR技術一致。 
PCR技術是一種體外快速擴增特異基因或DNA序列的方法，由Mullis等于1985年首創。該技術在試管中建立反應體系，經數小時后，就能將極微量的目的基因或某一特定的DNA片段擴增數百萬倍。其原理與細胞內發生的DNA復制過程相類似，首先是雙鏈DNA分子在鄰近沸點的溫度下加熱時便分離成兩條單鏈DNA分子，然后DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，并利用反應混合物中的四種脫氧核苷三磷酸（dNTPs）合成新生的DNA互補鏈，以上過程為一個循環，每一個循環的產物可以作為下一個循環的模板，經過20-30個循環后，介于兩個引物間的特異DNA片段以幾何數得以大量復制。 

RAPD標記技術就是用一個（有時用兩個）隨機引物（一般8-10個堿基）非定點地擴增基因組DNA，然后用凝膠電泳分開擴增片段。遺傳材料的基因組DNA如果在特定引物結合區域發生DNA片段插入、缺失或堿基突變，就有可能導致引物結合位點的分布發生相應的變化，導致PCR產物增加、缺少或發生分子量變化。若PCR產物增加或缺少，則產生RAPD標記。 
RAPD標記的主要特點有：（1）不需DNA探針，設計引物也無須知道序列信息；（2）顯性遺傳（極少數共顯性），不能鑒別雜合子和純合子；（3）技術簡便，不涉及分子雜交和放射性自顯影等技術；（4）DNA樣品需要量少，引物價格便宜，成本較低；（5）實驗重復性較差，結果可靠性較低。 
3 AFLP 
由Zabeau和Vos于1993年發明。AFLP標記是選擇性擴增基因組DNA酶切片段所產生的擴增產物的多態性，其實質也是顯示限制性內切酶酶切片段的長度多態性，只不過這種多態性是以擴增片段的長度不同被檢測出來。該技術結合了RFLP的穩定性和PCR技術的簡便高效性，同時又能克服RFLP帶型少、信息量小以及RAPD技術不穩定的缺點。其基本技術原理和操作步驟如下：首先用限制性內切酶酶解基因組DNA，形成許多大小不等的隨機限制性片段；接著在這些片段的兩端連接上特定的寡聚核苷酸接頭（Oligo nuleotide adapter）；然后根據接頭序列設計引物，由于限制性片段太多，全部擴增則產物難以在膠上分開，為此在引物的3’端加入1-3個選擇性堿基，這樣只有那些能與選擇性堿基配對的片段才能與引物結合，成為模板被擴增，從而達到對限制性片段進行選擇擴增的目的；最后通過聚丙烯酰胺凝膠電泳，將這些特異性的擴增產物分離開來。 
AFLP標記的主要特點有：（1）由于AFLP分析可以采用的限制性內切酶及選擇性堿基種類、數目很多，所以該技術所產生的標記數目是無限多的；（2）典型的AFLP分析，每次反應產物的譜帶在50-100條之間，所以一次分析可以同時檢測到多個座位，且多態性極高；（3）表現共顯性，呈典型孟德爾式遺傳；（4）分辯率高，結果可靠；（5）目前該技術受ZL保護，用于分析的試劑盒昂貴，實驗條件要求較高。 
4 SSR（SSLP） 
由Moore等于1991年創立。SSR即微衛星DNA，是一類由幾個（多為1-5個）堿基組成的基序（motif）串聯重復而成的DNA序列，其長度一般較短，廣泛分布于基因組的不同位置，如（CA）n、（AT）n、（GGC）n等重復。不同遺傳材料重復次數的可變性，導致了SSR長度的高度變異性，這一變異性正是SSR標記產生的基礎。盡管微衛星DNA分布于整個基因組的不同位置，但其兩端序列多是保守的單拷貝序列，因此可以根據這兩端的序列設計一對特異引物，通過PCR技術將其間的核心微衛星DNA序列擴增出來，利用電泳分析技術就可獲得其長度多態性，即SSR標記。 
SSR標記的主要特點有：（1）數量豐富，廣泛分布于整個基因組；（2）具有較多的等位性變異；（3）共顯性標記，可鑒別出雜合子和純合子；（4）實驗重復性好，結果可靠；（5）由于創建新的標記時需知道重復序列兩端的序列信息，因此其開發有一定困難，費用也較高。 
5 STS 
由Olson于1989年開發成功。STS是指基因組中長度為200-500bp，且核苷酸順序已知的單拷貝序列，通過PCR可將其專一擴增出來。其基本原理是，依據單拷貝的RFLP探針、微衛星序列、Alu因子等兩端序列，設計合適的引物，進行PCR擴增，電泳顯示擴增產物多態性。有時擴增產物還需要特定的限制性內切酶酶解后才能表現出多態性。目前用于STS引物設計的主要是RFLP探針。 
STS標記的主要特點有：（1）標記來源廣，數量多；（2）共顯性遺傳，可區分純合子和雜合子；（3）技術簡便，檢測方便；（4）與SSR標記一樣，開發依賴于序列分析及引物合成，成本較高；（5）多態性常常低于相應的RFLP標記，這是因為STS僅僅檢測該引物所分布區域的片段差異或酶切位置差異，而RFLP標記的多態性往往可能是探針以外區域的差異，這一部分差異無法轉化成STS標記的多態性。 
6 染色體原位雜交 
染色體原位雜交技術是DNA探針與染色體上的DNA雜交，并在染色體上直接進行檢測的分子標記技術。目前發展最快的是熒光素標記的原位DNA雜交技術，即熒光原位雜交技術（fluorescence in situ hybridization, 簡稱FISH技術），是利用與熒光素分子偶聯的單克隆抗體與抗原標記的探針分子特異性的結合來檢測DNA序列在染色體上的位置。用作植物染色體原位雜交的探針因研究目的不同有許多種，主要的有：用于物種起源和親緣關系研究的物種專化DNA序列或外源物種總基因組DNA；用來構建染色體物理圖譜的低拷貝或單拷貝序列；用于轉基因植物鑒定的含目的基因的BAC和YAC克隆。原位雜交技術的基本步驟為：制備探針；染色體制片；染色體處理與變性；染色體與探針雜交；顯微檢測。 
染色體原位雜交技術比較簡便，結果直觀。但其靈敏度和分辯率很大程度上依賴于制片技術和觀察設備，一般實驗室無法滿足需要。 


三 分子標記技術的應用 
1 分子遺傳圖譜的構建 
目前幾乎所有重要農作物，如擬南芥、番茄、玉米、水稻、甜菜、小麥、大豆、馬鈴薯、棉花、油菜等的RFLP圖譜均已構成，隨著多種標記的不斷添加與定位，分子遺傳圖譜正日漸趨于飽和。水稻第一張分子圖譜是美國cornell大學于1988年發表的，當時僅有RFLP標記136個，覆蓋水稻基因組的1389cM，標記分布也不甚均勻，有明顯的空白區域（Gap）；而由日本水稻基因組計劃1998年發表的水稻分子圖譜已包括了2275個標記，其中70%為EST，覆蓋了1550cM，平均圖距為1.5 cM。遺傳圖譜對于基因定位至關重要，圖譜上包括的標記數越多，分布越均勻，則基因定位就越精細。高密度分子遺傳圖譜的繪制使一些植物的遺傳學研究取得了重大進展，并對分子標記輔助育種選擇技術和基因圖位克隆技術的發展產生了巨大的推動作用。 
2 遺傳多樣性與種質鑒定 
分子標記廣泛存在于基因組DNA的各個區域，數量巨大，通過對隨機分布于整個基因組的分子標記的多態性進行比較，就能夠全面評估研究對象的多樣性，并揭示其遺傳本質。利用遺傳多樣性的結果可以對種質進行聚類分析，進而了解其系統發育與親緣關系。而以分子標記為基礎的比較基因組研究則有利于探明近緣物種間的遺傳同源性以及物種起源等生命科學領域中的重要問題。 
微衛星標記等具有很高的多態性，可以用于鑒別同一物種的不同基因型，如Olufowote等選擇4個SSR標記即可有效地評估栽培稻內不同品種間的異質性；Guifford等用3個SSR標記就能區分21個蘋果品種。分子標記的這一特點還可用于鑒別品種的混雜情況和真假雜種的判斷等。 
3 重要農藝性狀相關基因的定位 
基因定位就是確定基因在染色體上的位置及與之相連鎖的分子標記，高密度分子遺傳圖譜的構建使基因定位工作變得相對容易。 
目前已完成了重要作物大量控制農藝性狀表現如抗病性、抗蟲性、育性等的主基因的定位工作，為開展這些基因的分子育種奠定了基礎。尤為重要的是分子標記技術為呈數量遺傳、易受環境條件影響的重要農藝性狀的QTL定位提供了有效手段，目前涉及到QTL圖譜繪制及大量復雜的數據統計、分析、運算工作已有多個配套的計算機軟件被開發出來。QTL的定位使得控制數量性狀的多基因被轉變成一個個獨立的“主基因”，便于進行遺傳操作，這無疑有利于對產量、生育期等性狀的定向改良。 
4 分子標記輔助選擇 
選擇是育種的重要環節，傳統育種對目標性狀多采用直接選擇的方法，但作物的許多農藝性狀不容易觀測或易受環境影響、表現不穩定，直接選擇比較困難。而在完成基因的分子標記定位后，就可以通過連鎖標記對這些性狀進行間接選擇，從而提高它們的選擇效率。 
與傳統選擇相比，分子標記輔助選擇有許多顯著的優點，主要體現在：（1）可以清除同一座位不同等位基因間或不同座位間互作的干擾，消除環境的影響；（2）在幼苗階段就可以對在成熟期表達的性狀進行鑒定，如果實性狀、雄性不育等；（3）可有效地對表型鑒定十分困難的性狀進行鑒定，如抗病性、根部性狀等；（4）共顯性標記可區分純合體和雜合體，不需下代再鑒定；（5）可同時對多個性狀進行選擇，開展聚合育種，快速完成對多個目標性狀的同時改良；（6）加速回交育種進程，克服不良性狀連鎖，有利于導入遠緣優良基因。 
將分子標記輔助選擇應用于作物改良的實踐中，已取得一些實質性進展。如國際水稻所利用與Xa-4，xa-5，xa-13和Xa-21四個抗白葉枯病基因連鎖的STS標記輔助選擇，成功地將這四個基因以不同組合方式聚合在一起，育成了高抗、多抗白葉枯病水稻新品種。不過目前多數相關研究還停留在輔助選擇的技術策略方面，成功的事例很少。究其原因有：（1）直接交給育種家使用的PCR為基礎的標記還不多，已篩選出的標記在不同遺傳背景下不穩定；（2）還缺乏真正意義上的低成本、高效率、操作簡便的標記檢測體系；（3）部分研究人員的知識結構不合理，植物育種家與分子遺傳學家之間的有機結合、相互溝通不夠。 
5 重要農藝性狀的圖位克隆 
圖位克隆（Map-based cloning）是近幾年隨著植物分子標記遺傳圖譜的相繼建立和基因分子定位而發展起來的一種新的基因克隆技術。利用分子標記輔助的圖位克隆無須事先知道