單分子實時測序技術的三大優勢

發布時間：2013-09-04 09:48 原文鏈接：單分子實時測序技術的三大優勢

　　Biosciences的單分子實時測序技術(SMRT)因其出色的讀長而引人注目。然而，因通量較低，且一直被錯誤率高的流言所困擾，SMRT技術似乎有些被忽視。近日，幾位著名科學家在《Genome Biology》雜志上發表文章，試圖消除這些誤解，為SMRT正名。

　　這篇文章的通訊作者是New England Biolabs公司的首席科學家Richard J.Roberts博士。他也是1993年諾貝爾醫學獎獲得者。另外兩名作者分別來自Poad研究院和冷泉港實驗室。作者認為，當今的新一代測序技術有一些明顯的限制，特別是讀長短和擴增偏向，這限制了我們對完整基因組測序的能力。同時，隨著新一代測序技術的興起，人們的重點似乎也不放在新發現的基因有何功能，而那些功能如何讓生物體工作，但這正是我們測序的首要原因。

　　然而，SMRT這項新技術不僅能從單個未擴增的分子中產生更長且高度準確的DNA序列，還能顯示甲基化的堿基存在于何處，從而提供了有關DNA甲基化酶的功能信息。如今，PacBio RS II的平均讀長達5,000 bp，最長讀長超過20,000 bp，通量也較之前的版本增加一倍。

　　作者在文中提到，SMRT技術具有三大優勢。首先，長的讀長特別適合新穎基因組的de novo組裝。盡管新一代測序能夠提供基因組的深度覆蓋，但短的讀長和擴增偏向會導致片段化的組裝，特別是在遇到復雜重復或擴增不佳的區域時。利用 SMRT測序運行的長reads，它將覆蓋更多重復和缺失的堿基，從而自動消除缺口，節省整理時間。目前細菌基因組正利用這種方法完全組裝，他們希望這種做法在不久的將來會轉化到更大的基因組。

　　其次，考慮到DNA甲基化酶。這些作為單獨的實體或限制-修飾系統的一部分而存在。在這兩種情況下，DNA甲基化酶對相對短的序列motif進行甲基化，因DNA聚合酶的動力學有所改變，從而很容易從SMRT序列數據中識別。此外，SMRT測序也能識別RNA堿基修飾，不過要用RNA轉錄酶取代DNA聚合酶。因此，通過這種測序方法可直接獲取功能信息。

　　第三就是關于SMRT測序不如其他NGS平臺準確的流言。研究結果已表明，SMRT測序與其他測序技術在確定遺傳多態性上的性能相當。同時，利用SMRT測序及其他技術來組裝完整基因組被證明與傳統方法同樣可靠且準確。此外，也有人證明，只利用SMRT測序reads進行組裝實現了與其他平臺相當甚至更好的性能。

　　作者也進一步談了平臺錯誤率。他們認為，SMRT測序數據的優勢在于其讀長長和錯誤的隨機性。單個reads確實包含較多的錯誤：大約11%-14%，或Q12- Q15，而Illumina為Q30-Q35。然而，考慮到足夠的深度(比方說8x或更高)，SMRT測序提供了高度準確的基因組序列，因為同一錯誤不可能被觀察到很多次。

　　作者總結道，將其他技術的序列密集數據與中度覆蓋的SMRT數據相結合，可改善基因組，獲得它們的甲基化模式，并推導出甲基化轉移酶基因的功能活性。作者呼吁從事細菌基因組研究的所有小組采用這一策略。

　　此外，隨著PacBio RS II儀器的推出，作者認為SMRT測序有望更廣泛地應用于真核基因組的組裝。