標本的制備
原位PCR技術可應用于細胞懸液、細胞涂片、冰凍切片以及石蠟切片。相比較而言，以懸浮的完整細胞做原位PCR效果最好，石蠟切片效果最差。隨著技術方面的一些問題被解決，近年也有從石蠟切片中得到滿意的PCR效率的報道。效果不好的原因是多方面的，如：玻片上做PCR，熱傳導較差，熱對流不均勻，TaqDNA酶被玻璃片吸附等，更為主要的原因，可能是標本經制片后，細胞缺乏完整的胞漿或核膜，擴增產物易發生彌漫而導致擴增的產物在原位不易保留。絕大多數的病理標本都是以福爾馬林固定，石蠟包埋的形式保存的，若能很好地解決石蠟切片原位
PCR的有關技術問題，意義顯然是十分重大的。
組織細胞的固定 一般認為組織細胞以10%的緩沖福爾馬林或4%的多聚甲醛固定后進行原位 PCR效果較好。固定的時間一般不宜過長，視組織的大小，一般以4℃4-6小時為宜。
切片的厚度 一般而言，切片若厚一些，原位PCR的效果也較好一些，因為切片越厚，靶DNA的含量也就越多，同時膜結構也較多，防止擴增產物彌散的作用也越明顯。但厚切片細胞重疊多，形態學觀察的效果就差了，分辨率也將下降。
玻片的處理 為防止石蠟切片在PCR和原位雜交過程中脫落，在玻片應作防脫片處理，常用的方法是涂以多聚賴氨酸或用硅烷化處理，一般能防止組織脫落。
蛋白酶的消化作用
在進行原位擴增之前，組織標本需經蛋白酶處理。經蛋白酶消化的組織細胞，可增加其通透性，充分允許反應體系中的各成分進入細胞內，并能很好的暴露靶序列，以利于擴增。常用的蛋白酶有蛋白酶K，胰蛋白酶或胃蛋白酶。蛋白酶消化的程度就要根據組織固定的程度進行調整。蛋白酶消化后，要注意加熱以滅活酶的活性或通過充分的洗滌將酶完全去除，因為只要有少量的殘留酶存在，都將對隨后進行的PCR反應體系的數量TaqDNA酶產生毀滅性的影響。
蛋白酶消化處理組織細胞可提高通透性，有利于后續進行的各反應成分進入細胞內或核內，但同時也使得擴增產物的彌散機會增多，有可能帶來假陽性或假陰性的結果。
原位擴增（PCR）
原位擴增即在組織細胞標本上進行PCR反應，其基本原理與液相 PCR完全相同。
引物 PCR所用的引物一般為15-30bp為宜，擴增的片斷為100-1000bp左右。原位PCR宜用較短的引物。從石蠟切片中提取的DNA很少超過400bp，RNA很少超過200bp，較長序列的擴增易引起引物與模板的錯配而導致非特異性反應的出現。
反應體系
原位PCR的反應體系與常規的液相PCR基本相同，由于是在經過固定的組織切片上進行，為獲得較好的擴增效果，有人主張反應體系中的引物，TaqDNA聚合酶以及Mg2+的濃度均應高于液相的PCR反應體系。在反應體系中要加入牛血清白蛋白（BSA）,以防止TaqDNA聚合酶與玻片的結合而降低了擴增效率。
熱循環 原位PCR的熱循環可在專門的熱循環儀上進行，操作簡便。也可在一般的PCR熱循環儀上進行，通常在樣品臺上覆蓋一層鋁箔，制成平臺，樣品臺上的空間用礦物油或水充填，將載玻片至于平臺上，即可進行熱循環的步驟。
為了保證進行充分的擴增，原位PCR熱循環中每一步驟的時間可比常規PCR略長些，另外，也可采用熱啟動（hot start）的方法，即玻片加熱到80-94℃時，再立即加入TaqDNA聚合酶。
為了保證反應體系在熱循環過程不過多丟失，可用清亮的指甲油，礦物油或PAP筆把蓋片四周封閉起來。
洗滌 原位擴增結束后，標本應清洗，以除去彌散到細胞外的擴增產物。洗滌不充分，會導致擴增產物在檢測時顯現，造成背景過深或假陽性結果的出現。但是，洗滌過度，也會造成細胞內擴增的產物被洗脫，是陽性信號減弱或丟失。
有作者在擴增后用4%多聚甲醛2小時或2%戊二醛5分鐘進行后固定，以使擴增的產物在檢測時能很好地保留在細胞內，提高檢測的敏感性和特異性。
原位檢測
原位PCR的擴增產物檢測方法，取決于原位PCR的設計方案，直接法則根據標記分子的性質對擴增產物直接進行原位檢測。間接法則需用原位雜交的方法進行檢測。
熒光素、生物素、堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶標記的檢測，與免疫組織化學技術和親和組織化學技術相同，詳見前述。
原位雜交的基本步驟詳見核酸雜交一章。
原位PCR技術的應用
原位PCR技術的突出優勢，就是能在組織細胞原位檢測出拷貝數較低的特異性基因序列。按照待測基因的性質，可將原位PCR的應用分為檢測外源性基因和內源性基因兩方面。
1、用于外源性基因的檢測
（1）病毒基因的檢測
感染病毒的細胞常無較好的檢測手段，但當原位PCR技術應用后，使這一極為困難的問題有望解決。
對HIV、HPV、HSV、HBV、HCV等多種病毒的檢測，使我們能夠成功等觀察到這些病毒在艾滋病、生殖系統腫瘤、肝炎及肝癌中的作用，能夠及時發現受感染的人群。
（2）細菌基因的檢測
最突出的應用是在結核桿菌的檢測上，當結核病變不夠典型時，經過特殊染色的方法（詳見第一篇第五章）很難在鏡下找到結核桿菌，而應用原位PCR技術可幫助明確診斷，當結核桿菌很少時仍能在鏡下被很容易地找出來。
（3）導入基因的檢測
在轉基因動物的研究中，是否導入了基因，在接受基因治療的患者體內，是否接受了導入的基因，均可用原位PCR技術來證實。因此，原位PCR技術成為重要的檢測手段。
2、 用于內源性基因的檢測
（1）異常基因的檢測
機體內基因的突變、重排、也可用原位PCR技術進行檢測，原癌基因，抑癌基因的突變，惡性淋巴瘤免疫球蛋白重鏈基因的重排，對腫瘤的研究和診斷無一均提供了廣闊的應用前景。
（2）固有基因的檢測
對于機體細胞內只有單個或幾個拷貝的低表達固有基因，原位雜交技術因基因拷貝數太少而無能為力，液相PCR雖可進行擴增檢測出來，但不能確定含有該基因的細胞類型，原位PCR技術則彌補了上述兩種技術的不足，使得我們能夠對人類各種基因進行檢測，而完成人類基因圖的繪制。