雙歧桿菌核酸檢測試劑盒

雙歧桿菌核酸檢測試劑盒

本試劑盒選取一對雙歧桿菌(BD)特異性引物和一條特異性熒光探針，應用堿裂解法提取DNA，后者在耐熱DNA聚合酶(Taq酶)作用下，配以FQ-Buffer(內含Mg2+、Tris-HCl等)、四種核苷酸單體（dNTPs）等成分，用PCR-熒光探針體外擴增法對雙歧桿菌(BD)DNA進行擴增，從而達到快速定量檢測之目的。

標本采集、保存和運輸：
適用標本類型：食道、食品及乳制品(如乳酪、酸奶)及培養菌等樣本。
標本采集：
食道內容物：取疑似動物或人食道(胃、十二指腸、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、直腸等)內食物殘渣或糞便組織約100-200mg組織，轉至一盛有1ml生理鹽水的離心管中，密閉送檢。
乳制品：取疑似乳制品1g(或1ml)，轉至一盛有1ml生理鹽水的離心管中，密閉送檢。
3. 保存和運輸：上述標本短期內可保存于-20℃，長期保存可置-70℃。但不能超過6個月，標本運送應采用0℃冰。

使用方法
1．DNA提取
1.1食道內容物：充分混勻上述標本，將其轉至一潔凈的1.5ml 離心管中，13,000rpm離心1分鐘，棄上清，加入1ml生理鹽水，充分震蕩，13,000rpm離心1分鐘，棄上清，沉淀加250μl核酸提取液B 充分混勻（提取液用前需室溫溶解并充分混勻）后100℃10分鐘， 13,000rpm離心3分鐘，取上清液250μl轉至一潔凈的1.5ml離心管中，加750μl無水乙醇，充分混勻，13,000rpm離心5分鐘，盡量丟棄上清，空氣中干燥5-10分鐘，待乙醇揮發干凈后加50μl陰性質控品溶液沉淀，后取4μl做PCR反應。
1.2 培養菌：直接取100μl菌液，轉移至1.5ml離心管中，13,000rpm離心5分鐘；去上清，沉淀中加入50μl DNA核酸提取液B充分混勻。100℃恒溫處理10分鐘；13,000 rpm離心3分鐘，取上清液4ul做PCR反應。
陰性質控品：取50μl陰性質控品，加50μl核酸提取液B充分混勻(提取液用前需室溫溶解并充分混勻)后100℃10分鐘，13,000rpm離心3分鐘，取上清液4μl做PCR反應。
BD陽性質控品：直接取4μl進行PCR擴增，或按照PCR擴增介紹方法進行定量分析。
2．PCR擴增
從試劑盒中取出BD-PCR MIX、Taq酶系，室溫融化并振蕩混勻后，10,000rpm離心10s。
設所需要的PCR反應管管數為N（N=樣本數+1管陰性對照+1管陽性對照），每個測試反應體系配制如下表：
試劑    BD-PCR MIX    Taq酶系
用量    24μl    2μl
計算好各試劑的使用量，加入一適當體積潔凈離心管中，充分混勻，10,000rpm離心10s，向設定的N個PCR反應管中分別加入26μl，向每管中加入處理后樣品或BD-陽性定量標準品(使用前用陰性質控品梯度稀釋10倍、100倍、1000倍，記為1×10P6PCopies/ml，1×10P5PCopies/ml，1×10P4PCopies/ml)和陰性質控品4μl，10,000rpm瞬時離心30秒。將各反應管放入定量PCR儀器的反應槽內，按對應順序設置陰性質控品，陽性定量標準品以及未知標本，并設置反應體積(30μl)、樣品名稱、標記熒光基團種類(報告基團為FAM，淬滅基團為TAMRA)和循環條件:
ABI PRISM 7700，ABI PRISM5700，ABI GeneAmp 7000 (需要剪掉反應蓋)，ABI PRISM7300/7500(使用8聯管)，MJ Opticon(使用8聯管)等使用薄壁管的儀器，循環條件：94℃→2分鐘，后93℃ 30秒→55℃ 45秒， 40個循環。
LightCycler等使用毛細管的儀器，循環條件：94℃→2分鐘，后93℃ 5秒→56℃ 45秒，共40個循環。
3．結果分析判定
反應結束后保存檢測數據文件。根據分析后圖像調節baseline的start值（3~8），stop值（13~18）以及Threshold值，使Std curve 窗口下的標準曲線達到zui佳（correlation數值介于-0.97~-1之間，correlation數值等同于∣r∣值），zui后到Reporter窗口下記錄儀器自動分析計算出的未知標本數值（Qty-Copies/ml）。