試劑、試劑盒 乙酸銨氯仿異戊醇DMSO乙醇NaOH酚測序反應緩沖液瓊脂糖凝膠寡核苷酸引物閉環雙鏈質粒 DNA
儀器、耗材 干冰-乙醇浴65°C 水浴
實驗步驟
材料
緩沖液和溶液
試劑、緩沖液、儲液的組成參見附錄 1, 儲液使用前稀釋到適當濃度。
乙酸銨（5mol/L, 非緩沖，pH~7.4)
氯仿：異戊醇（24:1,V/V)
DMSO
可選用，請參見步驟 10。
乙醇
NaOH(2mol/L)/EDTA(2 mmol/L)
使用前將 10mol/L 氫氧化鈉儲液稀釋到合適濃度。
酚，用水或 TE(pH7.6) 平衡。
測序反應緩沖液
凝膠
瓊脂糖凝膠（0.8% m/V)
核酸和寡梭苷酸
寡核苷酸引物
變性雙鏈 DNA 模板測序所用寡核苷酸引物一般比單鏈 DNA 模板測序所用引物要長 20~30 個核苷酸。
變性雙鏈 DNA 模板測序使用長引物可以減少假帶的出現。
結合靶區域上游載體序列的通用引物表見第 8 章信息欄“通用引物”，并參閱本章信息欄“DNA 測序引物儲液配制”。
閉環雙鏈質粒 DNA
從培養菌體中小規模或大規模制備質粒 DNA 方法見第 1 章，也可以按照本方案后面的備選方法進行。
四組一套的測序反應（ddA,ddG、ddC、ddT) 需要 5ug DNA。
專用設備
干冰-乙醇浴
65°C 水浴
方法
1. 取 5ug 純化質粒 DNA 加至 1.5 ml 微量離心管中，補加水至總體積為 50ul。加入10ul 新配制的 2mol/LNaOH/2 mmol/LEDTA 溶液，室溫放置 5 min。
2. 加入 30ul 5mol/L 乙酸銨，渦旋振蕩混勻。
3. 加入 45ul 平衡酚，渦旋振蕩混勻。
4. 加人 135 氯仿: 異戊醇，渦旋振蕩混勻。然后在室溫下用微量離心機以最大轉速離心 15 min。
5. 小心吸取上層水相至一干凈微量離心管中，加入 330ul 冰預冷乙醇，混勻。置于干冰-乙醇浴中，放置 15 min。
6. 在下用微量離心機以最大轉速離心 15 min, 回收變性 DNA。
7. 仔細傾去上清液，不要攪動 DNA 沉淀，DNA 沉淀在管壁上可能看得見，也可能看不見。
8. 重新離心 2S，用 Tip 頭將殘存的痕量乙醇吸干凈，不要攪動 DNA 沉淀。
9. 在室溫下涼干 DNA 沉淀，然后用蒸餾水重新溶解 DNA, 使其終濃度為 lug/ul。
10. 退火使引物 DNA 與變性模板結合，對于四組一套的 DNA 測序反應使用 5ug(5ul)堿變性質粒 DNA(如在含有 ddA 的反應中，變性 DNA 的量為 1.25ug; 在含有ddG 的反應中，變性 DNA 的量為 1.25ug; 依此類推）。設立退火反應如下：
堿變性 DNA 5.0ug（溶于 5ul 水中）
DMSO(*可選） 2.0ul
測序蘼反應緩沖液 2.0ul
測序引物 10.ul(10ug)
水 至終體積 11.0ul
*請參見方案 4 的疑難解答。
加熱混合物至 65°C,2 min。然后使之緩慢冷卻至室溫。將退火的樣品保存于冰上，直至進行延伸/鏈終止反應。
11. 接著按方案 3 的步驟 3 進行。