口蹄疫分子生物學診斷技術

近年來，由于分子生物學技術的迅速發展及其在FMD診斷中的應用，建立了各種FMD的分子生物學診斷技術，主要包括以下幾種方法，核酸雜交、等電點聚焦電泳、寡核苷酸指紋圖譜分析、聚丙烯酰胺凝膠電泳、聚合酶鏈式反應、單克隆抗體技術等。

（1）核酸探針 核酸探針即應用FMD的cDNA克隆片段，用32P或生物素等標記后制備探針，根據標記片段的不同，可以檢測各群（群特異性探針）或某一型（型特異性探針）FMDV的RNA，如McFarlance等的報道。應用A12亞型的全基因組cDNA以及O1型、C1型和Asial型的VPl基因片段制備核酸探針，前者可以檢出O型、A型、C型和Asial型FMDV，而后者則可分別檢出各自相對型的FMDV。國內學者吳時友、楊永欽等報道應用cDNA探針成功檢出FMDV，隨著PCR技術的建立極大地方便了核酸探針的制備和應用。只要正確選用恰當的核酸片段，完夠制備群特異、型特異的核酸探針檢測FMDV的RNA。1998年Rossi和Sadir等用’’P標記克隆在質粒上的FMDV基因組聚合酶序列作為探針，對試驗感染牛的食道／咽部刮取物進行了檢測，認為此法為進出口動物FMD檢疫提供了快速、準確的檢測方法。利用固相雜交檢測和區分FMDV，利用核酸探針檢測FMDV持續感染細胞的病毒RNA也有不少報道。核酸雜交分析方法已經不再應用為FM—DV的診斷方法，與PCR方法相比它靈敏度與特異性均較低，但作為闡述持續性感染的（細胞基礎）核酸雜交分析方法則依然具有一定的作用。

（2）電聚焦 電聚焦是根據等電點的不同來分離像蛋白質這樣的兩性電解物。FMDV的結構和成分比較簡單，完整的病毒粒子（1468）衣殼由lA（VP4）、lB（VP3）、1C（VP2）和1D（VPl）4種結構蛋白組成。在電聚焦技術中，FMDV誘導的肽都能聚焦清晰，通常是單一的區帶，而且成熟多肽數量少，能產生單一的電聚焦型，可在單向電聚焦時與其他病毒帶對照比較。因此，電聚焦技術在FMDV流行病學研究中具有較大的運用潛力，常被用于FMDV病毒株的遺傳變異分析，以及特異型別研究中。在研究FMDV突變的物理圖、病毒誘導的前體蛋白與zui終產物的相互關系、病毒的遺傳重組、測定蛋白的分子質量、病毒的演化、毒株的鑒定、病毒的分類、肽的指紋圖、蛋白的二級修飾等方面，等電點聚焦電泳技術均得到了應用。

（3）核酸序列分析 將RT-PCR與核酸序列測定相結合而成的核酸序列分析方法，在FMDV研究中已得到日益廣泛的應用。Beck等將歐洲當時FMD暴發中分離的流行毒株與20年前分離并作為疫苗株的9株病毒VPl基因序列進行比較分析（FMDV的VPl蛋白能刺激機體產生中和抗體，起著重要的抗原作用），結果表明大多數毒株同疫苗毒株關系密切，因而推測大多數歐洲暴發的FMD并不是外部傳人的，而可能是甲醛滅活不徹底引起的。他通過對核酸序列分析與其他方法的優缺點比較，建議把核酸序列分析作為一種標準的診斷方法。近年來核酸序列分析方法在FMD中主要用于疫源追蹤、毒型鑒定和毒株的遺傳學系統樹分析。

（4）寡核苷酸指紋圖譜分析 1981年King和Underwood等應用此方法比較了1981年英國流行的FMDVO型Jexsey和Wight島毒株，同期法國流行的O型Brittany和Normandy毒株與疫苗毒株Lausanne和其他有關的奧地利、印度、泰國毒株間的寡核苷酸指紋圖。

（5）聚丙烯酰胺凝膠電泳技術（PAGE） Harris和Brown用聚丙烯酰胺凝膠電泳對FMDV南非I型強毒株和弱毒株進行了生物化學分析。在不同毒株的比較和抗原變異方面也有應用。

（6）單克隆抗體技術（McAb） 仔細地選擇單克隆抗體可以替代實驗中的多克隆血清。在FMDV抗原位點的研究、抗原關系的研究、診斷和檢疫方面都有應用。另外，近幾年來也開展了抗獨特型抗體在FMD的免疫、診斷和治療方面的研究工作。