（1）攝入不足 葉酸每天的需要量為200～400μg。人體內葉酸的儲存量僅夠4個月之需。食物中缺少新鮮蔬菜、過度烹煮或腌制均可使葉酸丟失。乙醇可干擾葉酸的代謝，酗酒者常會有葉酸缺乏。小腸（特別是空腸段）炎癥、腫瘤、手術切除及熱帶性口炎性腹瀉均可導致葉酸的吸收不足。
（2）需要增加 妊娠期婦女每天葉酸的需要量為400～600μg。生長發育的兒童及青少年以及慢性反復溶血、白血病、腫瘤、甲狀腺功能亢進及長期慢性腎功能衰竭用血液透析治療的患者，葉酸的需要都會增加，如補充不足就可發生葉酸缺乏。
（3）藥物的影響 如甲氨蝶呤、氨苯蝶啶、乙胺嘧啶能抑制二氫葉酸還原酶的作用，影響四氫葉酸的生成。苯妥英鈉、苯巴比妥對葉酸的影響機制不明，可能是增加葉酸的分解或抑制DNA合成。約67%口服柳氮磺胺吡啶的患者葉酸在腸內的吸收受抑制。
（4）其他 先天性缺乏5，10-甲酰基四氫葉酸還原酶的患者，常在10歲左右才被診斷。有些加強護理病房（ICU）的患者常可出現急性葉酸缺乏。