增加PCR特異性（一）
引物設計
細心地進行引物設計是PCR中最重要的一步。理想的引物對只同目的序列兩側的單一序列而非其他序列退火。設計糟糕的引物可能會同擴增其他的非目的序列。下面的指導描述了一個可以增加特異性的引物所具有的令人滿意的特點：
1.典型的引物18到24個核苷長。引物需要足夠長，保證序列獨特性，并降低序列存在于非目的序列位點的可能性。但是長度大于24核苷的引物并不意味著更高的特異性。較長的序列可能會與錯誤配對序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產量。
2.選擇GC含量為40％到60％或GC含量映像模板GC含量的引物。
3.設計5'端和中間區為G或C的引物。這會增加引物的穩定性和引物同目的序列雜交的穩定性。
4.避免引物對3'末端存在互補序列，這會形成引物二聚體，抑制擴增。
5.避免3'末端富含GC。設計引物時保證在最后5個核苷中含有3個A或T。
6.避免3'末端的錯誤配對。3'端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。
7.避免存在可能會產生內部二級結構的序列，這會破壞引物退火穩定性。
目的序列上并不存在的附加序列，如限制位點和啟動子序列，可以加入到引物5'端而不影響特異性。當計算引物Tm值時并不包括這些序列，但是應該對其進行互補性和內部二級結構的檢測。
有時候，對于引物設計僅了解有限的序列信息。比如，如果僅知道氨基酸序列，可以設計兼并引物。兼并引物是指代表編碼單個氨基酸所有不同堿基可能性的不同序列的混合物。為了增加特異性，可以參考密碼子使用表，根據不同生物的堿基使用偏好，減少兼并性。次黃嘌呤可以同所有的堿基配對，降低引物的退火溫度。不要在引物的3'端使用兼并堿基，因為3'端最后3個堿基的退火足以在錯誤位點起始PCR。使用較高的引物濃度（1μM到3μM），因為許多兼并混合物中的引物不是特異性針對目的模板。
增加PCR特異性（二）
2。引物退火溫度
引物的另一個重要參數是熔解溫度（Tm）。這是當50％的引物和互補序列表現為雙鏈DNA分子時的溫度。Tm對于設定PCR退火溫度是必需的。在理想狀態下，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效退火，同時還要足夠高，以減少非特異性結合。合理的退火溫度從55℃到70℃。退火溫度一般設定比引物的Tm低5℃。
設定Tm有幾種公式。表4列出確定引物Tm最常用的兩種方法。第一個公式來源于高鹽溶液中的雜交，適用于小于18堿基的引物。第二個公式根據GC含量估算Tm。確定引物Tm最可信的方法是近鄰分析法。這種方法從序列一級結構和相鄰堿基的特性預測引物的雜交穩定性。大部分計算機程序使用近鄰分析法。
根據所使用的公式及引物序列的不同，Tm會差異很大。因為大部分公式提供一個估算的Tm值，所有退火溫度只是一個起始點。可以通過分析幾個逐步提高退火溫度的反應以提高特異性。開始低于估算的Tm5℃，以2℃為增量，逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會減少引物二聚體和非特異性產物的形成。為獲得最佳結果，兩個引物應具有近似的Tm值。引物對的Tm差異如果超過5℃，就會引物在循環中使用較低的退火溫度而表現出明顯的錯誤起始。如果兩個引物Tm不同，將退火溫度設定為比最低的Tm低5℃。或者為了提高特異性，可以在根據較高Tm設計的退火溫度先進行5個循環，然后在根據較低Tm設計的退火溫度進行剩余的循環。這使得在較為嚴緊的條件下可以獲得目的模板的部分拷貝。
3。遞減PCR
遞減PCR通過在PCR的前幾個循環使用嚴緊的退火條件提高特異性。循環開在比估算的Tm高大約5℃的退火溫度下開始，然后每個循環降低1℃到2℃，直到退火溫度低于Tm 5℃。只有同同源性最高的目的模板會被擴增。這些產物在隨后的循環中繼續擴增，并會將擴增的非特異性產物排擠出去。遞減PCR對于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法較為有用，如AFLP? DNA指紋分析。
4。引物濃度
引物的濃度會影響特異性。最佳的引物濃度一般在0.1到0.5μM。較高的引物濃度會導致非特異性產物擴增。
為了確定引物濃度，可以在260nm（OD260）測量光密度值。然后使用光吸收值和微摩消光系數的倒數（nmol/OD），通過Beers法則（公式1）計算引物濃度。微摩消光系數可以使用公式2計算。與大分子雙鏈DNA可以使用平均消光系數不同，確定引物的精確濃度必須使用計算的消光系數。這是因為引物較短，堿基組成差異很大。在Gibco/BRL定制引物的質檢報告中包含了消光系數（OD/μmol）和消光系數的倒數（μmol/OD）。另外，不要使用寡聚核苷酸作為標準，在EB染色的膠上估算引物濃度，因為引物和標準的染色能力根據序列不同而差異很大。
增加PCR特異性（三）
5。引物純度和穩定性
定制引物的標準純度對于大多數PCR應用是足夠的。使用Life Technologies? Parallel Array Synthesis™技術，不必除鹽。同其他方法相比，在Parallel Array Synthesis™技術中，因脫鹽而除去的苯甲酰基和異丁酰基很少，因此不會干擾PCR。部分應用需要純化，以除去在合成過程中的任何非全長序列。這些截斷序列的產生是因為DNA合成化學的效率不是100％。這是個循環過程，在每個堿基加入時使用重復化學反應，使DNA從3'到5'合成。在任何一個循環都可能失敗。較長的引物，尤其是大于50個堿基，截斷序列的比例很大，可能需要純化。
引物產量受合成化學的效率及純化方法的影響。Life Technologies以一個最小OD單位確保總寡核苷的產量。定制引物以干粉形式運輸。最好在TE重溶引物，使其最終濃度為100μM。TE比去離子水好，因為水的pH經常偏酸，會引起寡核苷的水解。
引物的穩定性依賴于儲存條件。應將干粉和溶解的引物儲存在-20℃。以大于10μM濃度溶于TE的引物在-20℃可以穩定保存6個月，但在室溫（15℃到30℃）僅能保存不到1周。干粉引物可以在-20℃保存至少1年，在室溫（15℃到30℃）最多可以保存2個月。