如何快速發現腫瘤中的熱點突變

　　去年10月，Ion Torrent推出了Ion AmpliSeq? Cancer Panel，它覆蓋了46個癌基因的相關區域。如今，Ion AmpliSeq? Cancer Hotspot Panel v2如今經過擴展，靶定50個癌基因和腫瘤抑制基因的“熱點”區域，廣泛覆蓋KRAS、BRAF和EGFR基因，讓轉化和臨床研究人員能夠快速追蹤腫瘤學研究。

　　此產品的引物設計經過改善，在單管中包含207對引物，僅需要10 ng DNA，讓研究人員能夠對FFPE組織等頗具挑戰性的樣品進行測序。方便的預設計產品使研究人員能夠專注于數據產生和分析，而不是費時費力的引物設計和目標選擇步驟。基于雜交的目標選擇方法需要7至72小時才能完成目標選擇和文庫制備，而Ion AmpliSeq? 技術利用簡單的PCR反應，僅需3.5小時即可完成整個過程。此外，Ion AmpliSeq? 文庫構建步驟可利用標準的96孔板步驟自動化，這進一步簡化了流程，讓大項目能夠迅速完成，而不需要額外的樣品轉移步驟。

　　FFPE測序的理想選擇 C 僅需要10 ng DNA

　　Ion AmpliSeq?技術的突破性在于，整個Ion AmpliSeq? Cancer Panel僅需10ng DNA，這樣即使是樣品量少且質量不穩定的FFPE樣品，也能得到準確地代表樣品。此外，此產品的引物經過設計，產生平均長度為154 bp的擴增子，因此即使是降解的樣品也能生成可靠數據。利用標準的PCR設備即可完成目標選擇，而無需額外投入。

　　最快產生目標文庫 C 3.5小時

　　從 DNA到已注釋變異的單日流程讓您可開展時間敏感的分析。其他任一種目標選擇方法都不能利用簡單的PCR反應在3.5小時內產生目標文庫。隨后可將文庫轉移到Ion OneTouch?系統，進行模板制備，并在Ion PGM?測序儀上進行測序。PGM? Torrent 服務器上的Torrent Suite軟件可開展自動化分析。使用Ion Reporter?軟件的最后一步是可選的，可開展包括變異注釋在內的自動化生物信息學分析。此軟件適用于常規的DNA分析(圖1)。

　　圖1. Ion AmpliSeq? Panel的流程，利用Ion 314?芯片和90分鐘、1 x 100 bp測序運行。

　　利用TaqMan? Assay來確認變異

　　TaqMan? Mutation Detection Assay能檢測45個癌癥相關基因的體細胞突變。分析以castPCR? 技術為核心，能在野生型DNA的背景下檢測低至0.1%的突變，這一點已通過加標實驗證明。或者，選擇Custom TaqMan? SNP Genotyping Assay，利用數字PCR對檢測到的突變進行確認。Torrent Suite軟件整合了TaqMan? Assay的搜索門戶，讓檢測到的變異可直接提交，便于TaqMan? Assay的進一步研究。

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Ion AmpliSeq? Cancer Hotspot Panel v2
目標	熱點區域，包括50個癌基因和腫瘤抑制基因的~2,800個COSMIC突變，廣泛覆蓋KRAS、BRAF和EGFR基因
擴增子長度	111-187 bp，平均154 bp
引物池大小	1管內207對引物
起始DNA	每個DNA樣品僅需10 ng
獲得結果的時間	10小時（DNA到已注釋的變異）
樣品多重分析（觀察到的性能）	Ion 314?芯片：2個樣品，~1,400x平均覆蓋度 Ion 316?芯片：8個樣品，~1,400x平均覆蓋度 Ion 318?芯片：16個樣品，~1,400x平均覆蓋度
	規格	觀察到的性能（Ion 314?芯片）
覆蓋均一性*	≥95%	≥98%
命中目標的讀取?	≥90%	≥96%
平均覆蓋深度	NA	>2,000x
SNP檢測靈敏度	NA	對于平均測序覆蓋度為1,000x至4,000x的位點，5%變異頻率的檢測率為98%