完美基因編輯:新方法可消除CRISPRCas的脫靶效應

　　前段時間，麻省理工的研究人員發現基因編輯工具CRISPR-Cas系統具有脫靶效應。近日，這個研究小組的負責人張峰教授表示，他們已經找到了影響CRISPR-Cas系統精確度的關鍵因素，這一發現將使該系統在人類細胞中的應用更安全。目前，這一研究發表在Nature Biotechnology上。

　　借助這項研究，科學家可以一次性破壞多個基因，從而提高治愈人類基因缺陷疾病的幾率。

　　脫靶效應

　　CRISPR-Cas RGN由DNA切割酶Cas9以及一條含20個核苷酸的RNA短鏈(作用是與目標DNA鏈匹配)組成。CRISPR-Cas RGN模擬的正是一些特定細菌的原始免疫系統。當這些微生物受病毒或其他生物感染時，它們會拷貝入侵者的一段遺傳編碼并整合至自己的DNA中，并遺傳給下一代。當子代細菌再次遭遇這些入侵者時，細菌的Cas9在與所整合DNA匹配的RNA鏈的向導下，在入侵者DNA的目標位置進行切割，從而使病原體失活。

　　大約一年前，科學家首次報道了利用重編程的CRISPR-CAS RGN靶定并切割特定的DNA位點。該技術依靠短鏈RNA片段對目標DNA進行靶定，使其相比其他的基因編輯工具，如ZFN、TALEN等均簡單易用，并且RGN經過改造后可同時在一個基因組中引入多個遺傳改變。

　　但是，CRISPR-Cas RGN可導致額外而非需要的遺傳改變的可能性則較少被研究過。因此美國麻省總醫院的Joung博士的團隊決定對CRISPR-Cas RGN在人類細胞中的脫靶現象進行研究。由于CRISPR-Cas RGN的指導RNA片段與目標DNA只依賴于20個核苷酸進行匹配，因而他們推測這段RNA有可能也會與目標外的其他片段發生結合。

　　盡管過往的研究表明，即便是一個核苷酸的錯配都可以阻止CRISPR-Cas RGN繼續發揮作用，但是麻省總醫院的這項研究卻發現，在人類細胞系中，多達5個核苷酸的錯配都未必阻止目標位點外的切割。他們還發現，脫靶位點的突變率與目標位點的突變率相同甚至更高。

　　消除脫靶效應

　　為了尋找到最佳的基因組序列，研究小組成員Patrick Hsu and David Scott建立了一個計算機模型。“每一個基因都有成百上千的位點可以進行編輯。利用計算機模型，可以識別幾乎任何一個基因。該模型可以幫助研究人員尋求最佳編輯位點。”麻省理工學院腦認知研究方向的助理教授張峰解釋道。

　　在需要對目的基因的功能進行破壞，或者要進行目的基因替換時都可以使用CRISPR-Cas系統。科研人員如果要進行目的基因替換，就必須在目的基因被切除后，將新基因的模板復制到基因組中。

　　傳統的建立轉基因小鼠的方法是將小片段DNA整合到小鼠胚胎干細胞中，但是其耗時長，并且效率低。這項新技術為建立轉基因小鼠提供了一個更快捷更有效的途徑。

　　Broad研究所和麻省理工學院McGovern研究院的張教授介紹說，只需要三個星期，CRISPR-Cas系統可以同時將多個基因一次性編輯完成，其還可以被應用于在實驗室中建立轉基因細胞系。

　　自從張峰教授的研究團隊在今年一月首次對 CRISPR-Cas系統進行闡述后，來自世界各地超過2000個實驗室已經開始使用該系統建立轉基因細胞系或者轉基因動物。

　　研究人員發現有兩種方式可以提高序列靶向特異性。第一種就是利用計算機模型。第二種方法就是調整導向RNA序列的量。在一般情況下，減小RNA序列的量可以減弱脫靶效應，但是不利于目的基因的裂解。對于每一個序列來說，高目標效應和低脫靶效應間存在一個最優的平衡點，這是可以計算出來的。

　　生物化學和分子生物學教授Michael Terns說：“這項研究的意義在于它對脫靶效應進行了系統和全面地分析，并且提出了減弱甚至消除脫靶效應的幾種方法。”

　　最新研究結果表明，增長RNA鏈可以提高RNA的結合效率。所以張峰教授和他的同事們對RNA片段的結構進行了優化。張峰教授說，經過優化的RNA片段包含穩定的發卡結構，能夠更有效的引導Cas9發揮作用。

　　張峰教授團隊下一步的研究計劃是，進一步提高CRISPR-Cas系統的特異性，并建立用來研究大腦神經回路的細胞系和動物。通過破壞參與大腦神經回路形成和發育的基因，探究其是如何發揮作用以及在神經系統疾病中是如何受損的。

　　革命性的意義

　　CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)是細菌用來抵御病毒侵襲/躲避哺乳動物免疫反應的基因系統。科學家們利用RNA引導Cas9核酸酶可在多種細胞(包括iPS)的特定的基因組位點上進行切割，修飾。 Rudolf Jaenisch 研究組將Cas9與Te1和Tet2特異的sgRNA共注射到小鼠的受精卵中，成功得到雙基因敲除的純合子小鼠，效率高達80%。 他們將Cas9/sgRNA 與帶突變序列的引物共注射，能準確在小鼠兩個基因引入所要的點突變。在ES細胞中他們更是成功的一次敲除了五個基因。與ZFN/TALEN相比，CRISPR/Cas更易于操作，效率更高，更容易得到純合子突變體，而且可以在不同的位點同時引入多個突變。

　　由于解決了CRISPR-Cas系統脫靶效應的問題，該技術可能會廣泛應用于小鼠，大鼠及其他模式動物的制備和研究中，成為傳統的轉基因和基因打靶技術的重要補充。