1、泵的構造和性能
輸液泵是 HPLC 系統中最重要的部件之一。泵的性能好壞直接影響到整個系統的質量和分析結果的可靠性。輸液泵應具備如下性能:流量穩定,RSD<0.5%,這對定性定量的準確性至關重要;流量范圍寬,分析型應在0.1～10mL/min 范圍內連續可調,制備型應能達到100mL/min;輸出壓力高,一般應能達到150～300kg/cm2;液缸容積小;密封性能好,耐腐蝕。
泵的種類很多,按輸液性質可分為恒壓泵和恒流泵。恒流泵按結構又可分為螺旋注射泵、柱塞往復泵和隔膜往復泵。恒壓泵受柱阻影響,流量不穩定;螺旋泵缸體太大,這兩種泵已被淘汰。目前應用最多的是柱塞往復泵。
柱塞往復泵的液缸容積小,可至0.1mL,因此易于清洗和更換流動相,特別適合再循環和梯度洗脫;改變電機轉速能方便地調節流量,流量不受柱阻影響;泵壓可達400kg/cm2。其主要缺點是輸出的脈沖較大,現多采用雙泵系統來克服。雙泵按連接方式可分為并聯式和串聯式,一般來說并聯泵的流量重現性較好(并聯泵 RSD 為0.1%左右,串聯泵 RSD 為0.2%～0.3%),但出故障的機會較多(因多一單向閥),價格也較貴。
2、泵的使用和維護注意事項
為了延長泵的使用壽命和維持其輸液的穩定性,必須按照下列注意事項進行操作。
①防止任何固體微粒進入泵體,因為塵埃或其他任何雜質微粒都會磨損柱塞、密封環、缸體和單向閥,因此應預先除去流動相中的任何固體微粒。流動相最好在玻璃容器內蒸餾,而常用的方法是過濾,可采用 Millipore 濾膜(0.2μm 或 0.45μm,分為有機系和無機系)等濾器。泵的入口都應連接砂濾棒(或片)。輸液泵的濾器應經常清洗或更換。
②流動相不應含有任何腐蝕性物質,含有緩沖液的流動相不應保留在泵內,尤其是在停泵過夜或更長時間的情況下。如果將含緩沖液的流動相留在泵內,由于蒸發或泄漏,甚至只是由于溶液的靜置,就可能析出鹽的微細晶體,這些晶體將和上述固體微粒一樣損壞密封環和柱塞等。因此,必須泵入純水將泵充分清洗后,再換成適合色譜柱保存和有利于泵維護的溶劑(對于反相鍵合硅膠固定相,可以是甲醇或甲醇-水或乙腈或乙腈-水)。
③泵工作時要留心防止溶劑瓶內的流動相被用完,否則空泵運轉也會磨損柱塞、缸體或密封環,最終產生漏液。
④輸液泵的工作壓力絕不要超過規定的最高壓力,否則會使高壓密封環變形,產生漏液。
⑤流動相應該先脫氣,以免在泵內產生氣泡,影響流量的穩定性,如果有大量氣泡,泵就無法正常工作。
如果輸液泵產生故障,須查明原因,采取相應措施排除故障。
①沒有流動相流出,又無壓力指示。原因可能是泵內有大量氣體,這時可打開泄壓閥,使泵在較大流量(如5mL/min)下運轉,將氣泡排盡,也可用一個 50mL 針筒在泵出口處幫助抽出氣體。另一個可能原因是密封環磨損,需更換。
②壓力和流量不穩。原因可能是存在氣泡,需要排除;或者是單向閥內有異物,可卸下單向閥,浸入丙酮內超聲清洗。有時可能是砂濾棒內有氣泡,或被鹽的微細晶粒或滋生的微生物部分堵塞,這時,可卸下砂濾棒浸入流動相內超聲除氣泡,或將砂濾棒浸入稀酸(如 4mol/L 硝酸)內迅速除去微生物,或將鹽溶解,再立即清洗。
③壓力過高的原因是管路被堵塞,需要清除和清洗;壓力降低的原因則可能是管路有泄漏。檢查堵塞或泄漏時應逐段進行。
3、梯度洗脫
HPLC 有等強度(isocratic)洗脫和梯度(gradient)洗脫兩種方式。等強度洗脫是在同一分析周期內流動相組成保持恒定,適合組分數目較少、性質差別不大的樣品。梯度洗脫是在一個分析周期內程序控制流動相的組成,如溶劑的極性、離子強度和 pH 值等,用于分析組分數目多、性質差異較大的復雜樣品。采用梯度洗脫可以縮短分析時間,提高分離度,改善峰形,提高檢測靈敏度,但是常常引起基線漂移和降低重現性。
梯度洗脫有兩種實現方式:低壓梯度(外梯度)和高壓梯度(內梯度)。
兩種溶劑組成的梯度洗脫可按任意程度混合,即有多種洗脫曲線:線形梯度、凹形梯度、凸形梯度和階梯形梯度。線形梯度最常用,尤其適合在反相柱上進行梯度洗脫。
在進行梯度洗脫時,由于多種溶劑混合,而且組成不斷變化,因此帶來一些特殊問題,必須充分重視。
①要注意溶劑的互溶性,不相混溶的溶劑不能用作梯度洗脫的流動相。有些溶劑在一定比例內混溶,超出范圍后就不混溶,使用時更要引起注意。當有機溶劑和緩沖液混合時,還可能析出鹽的晶體,尤其是使用磷酸鹽時需特別小心。
②梯度洗脫所用的溶劑純度要求更高,以保證良好的重現性。進行樣品分析前必須進行空白梯度洗脫,以辨認溶劑雜質峰,因為弱溶劑中的雜質富集在色譜柱頭后會被強溶劑洗脫下來。用于梯度洗脫的溶劑需徹底脫氣,以防止混合時產生氣泡。
③混合溶劑的黏度常隨組成而變化,因而在梯度洗脫時常出現壓力的變化。例如甲醇和水的黏度都較小,當二者以相近比例混合時黏度增大很多,此時的柱壓大約是甲醇或水為流動相時的兩倍。因此要注意防止梯度洗脫過程中壓力超過輸液泵或色譜柱能承受的最大壓力。
④每次梯度洗脫之后必須對色譜柱進行再生處理,使其恢復到初始狀態。需讓10～30倍柱容積的初始流動相流經色譜柱,使固定相與初始流動相達到完全平衡。