小量制備質粒DNA(強堿法)

實驗概要

本文介紹了強堿法小量制備質粒DNA的原理及操作流程。有助于了解基因工程操作中運載基因的載體，掌握最常用的提取質粒DNA的方法。

實驗原理

堿變性抽提質粒DNA是基于染色體DNA的變性與復性的差異而達到分離的目的。利用溶菌酶、強堿(NaOH)及表面活性劑(SDS)使細胞破壁、膜，釋放出胞內染色體DNA，質粒DNA及其它物質，通過一系列的純化過程:高鹽除核DNA，苯酚-氯仿抽提變性蛋白和脂類，最后用異丙醇(或乙醇)沉淀出質粒DNA和RNA等，  RNA再經RNase消化，得到質粒DNA，這種質粒DNA可用作基因工程的載體，更廣泛地用于重組子的鑒定。

主要試劑

1. 溶液1(GTE)    

50 mmol/l       葡萄糖

10 mmol/l        EDTA-Na₂

25 mmol/l        Tris-Cl  (pH 8.0)

4mg/ml           溶菌酶

2. 溶液2   

200 mmol/l       NaOH

1% SDS

3. 溶液3   

5 mol/l KAC    60 ml

冰乙酸        11.5ml

ddH₂O         28.5ml

4. 苯酚-氯仿

5. 異丙醇(或95%乙醇，100%乙醇)

6. 70%乙醇

7. TE (pH 8.0):  

10 mmol/l   Tris-Cl (pH 8.0)

1 mmol/l    EDTA-Na₂

8. RNase  1mg/ml       

9. Amp   100ug/ml

主要設備

1. 37℃搖床

2. eppendorf管

3. 高速離心機

4. 低溫冰箱

實驗材料

Ecoli InvaF'(pUC19)

實驗步驟

1. 挑取一單菌落的Ecoli InvaF'(pUC19)菌種接種到含Amp100ug/ml的LB液體培養基中，37℃振蕩培養過夜。

2. 吸1.4ml菌液至eppendorf管中，在高速臺式離心機上5，000g離心2min，倒去培養基。

3. 重復1次，盡可能倒出培養基并將管倒置于紙帕上，以吸干管壁上殘留的培養基，收集細菌。

4. 將細菌懸于500ul冰冷的溶液1中，于離心機上5，000g離心2min。

5. 倒去溶液1，再懸于200ul冰冷的溶液1中。

6. 加入300 ul新配制的溶液2，冰浴5 min。

7. 加入300ul冰冷的溶液3，中和，輕輕振蕩10sec，至冰浴5 min。

8. 于離心機上，10，000 g離心5min。

9. 取上清轉移至一新管中，并加入RNase酶至50ug/ml，于37℃水浴中溫浴30 min。

10. 加入等體積的飽和酚抽提1次，10，000 g離心5min取上清液。

11. 再加入等體積的氯仿抽提1次， 10，000 g離心5min取上清液。

12. 加入750ul異丙醇，沉淀質粒DNA， 10，000 g離心10min。

13. 倒去異丙醇，用70%乙醇洗滌沉淀，10，000 g離心5min。

14. 置冰箱內開蓋干燥，懸浮至40ul去離子水或TE中。