層析技術(Layeranalisetechnique)(3)

3．平衡 將DEAE―纖維素放入0.0lMol/L pH 7.4 PB液中（即起始緩沖液），靜止1h，不時攪拌，待纖維素下沉后，傾去上清液或抽濾除去洗液，如此反復幾次至傾出液體的pH值與加入的PB液的pH值相近時為止。

4．裝柱 層析柱的選擇要大小、長度適當。一般而言，柱長和柱直徑之比為10：1～20：1，柱的內徑上下要均勻一致。用前將層析柱在清潔液內浸泡處理24h，然后依次用常水、蒸餾水、起始緩沖液充分洗滌。

裝柱時，先剪一塊圓形的尼龍紗布（直徑與層析柱內徑一致），放入層析柱底部。將柱下端連接細塑料管，夾上螺旋夾。把層析柱垂直固定在三角鐵架上，倒入起始緩沖液至一半的柱高，除去死區及塑料管內的氣泡。再將平衡的DEAE－纖維素糊狀物沿管壁倒入柱中。注意不要產生氣泡，如有氣泡應排除或重裝。擰開螺旋夾，使流速至1ml/5min，待緩沖液快接近纖維素面時，繼續倒入纖維素糊，同時用玻璃棒攪拌表面層，以免使兩次加入的纖維素形成分界層，通過進出緩沖液調節流量，也可通過塑料管的升降來控制，至柱床體積不變為止。剪一圓形濾紙（與柱內徑大小一致），從柱的上端輕輕放入，使其沉接于纖維素床表面，以免在加樣時打亂纖維素層。裝好柱的柱面應該是平整的，無傾斜，整個柱床內無氣泡、不分層。繼續平衡，使流出液的pH值與流入液的pH值完全一致為止。

5．上樣 要層析的樣品首先必須用起始緩沖液（4℃）平衡過夜，中間可換液數次。將柱的上端打開，用吸管將纖維素柱上面的緩沖液吸出，不要吸凈，留一薄層液面，以免空氣進入。沿管壁緩緩加入樣品，注意不要打亂纖維素表層。擰開下端的螺旋夾，使樣品進入交換劑中，快要進完時，加1ml～2ml緩沖液沖洗柱壁，隨即用多量的洗脫液洗脫。

樣品的加量與DEAE―纖維素有一個最適比的關系，超過這個比值，吸附就不完全，直接影響到分離的純度。經過粗提的 ―球蛋白50mg～100mg，用干重約4g DEAE－纖維素裝柱分離，可獲得理想結果。

6．洗脫 對于陰離子交換劑而言，洗脫的辦法是使pH逐漸降低，而離子濃度逐漸升高。一般的辦法，是穩定一個因素而改變另一個因素洗脫。洗脫可采用分段洗脫和連續洗脫法，前者較實用，后者較準確。

表1－5 血清蛋白各成分的吸附與解吸的關系

表1－6 血清的分段洗脫成分

表1－7 各種Ig解脫吸附條件

7．洗脫液的收集 利用自動分步收集器收集，并以20%磺基水楊酸測試，當蛋白液下來時，開始分管收集，至無蛋白液為止。

8．交換柱的再生 將使用過的DEAE－纖維素移入 燒杯中，用2Mol/L NaCl液浸泡，抽濾并洗滌數次。如不立即使用，可加1/10 000的疊氮鈉防腐，保存于4℃冰箱中。使用時，再以堿－酸－堿處理。