工程化靶向性抗體融合蛋白的研究進展

前言

自從35年前FDA批準首個治療性抗體以來，抗體產品在醫藥市場上獲得了迅猛發展。在單克隆抗體成功的基礎上，最近的研究利用了抗體良好的特異性和藥代動力學特性來創造新的抗體融合蛋白，能夠靶向傳遞治療有效載荷。

目前，已有幾種抗體融合蛋白被批準作為治療藥物。早在1998年，依那西普（TNFR2與Fc結構域的融合）就被批準用于治療類風濕關節炎。自該批準以來，抗體融合蛋白通過將各種有效載荷，如細胞因子、毒素、酶、神經保護劑和可溶性細胞因子陷阱等連接到不同的抗體成分，包括全長抗體、Fc結構域、單鏈片段（scFvs）、單域抗體（sdAbs）和抗原結合片段（Fabs）。本文我們一起來關注這些抗體融合蛋白最新的臨床前和臨床研究進展。

腫瘤靶向的細胞因子抗體融合蛋白

免疫細胞因子作為癌癥治療藥物已得到廣泛地研究。最近，細胞因子抗體融合蛋白成為研究的熱門領域，包括IL-4、IL-15、TNFα、IL-2、IL-12、IL-21、IFN-α和IFN-β等。這些細胞因子在體內穩態中具有免疫刺激、免疫抑制或多效性作用。

為了將細胞因子有效載荷傳遞到腫瘤微環境（TME），最近開發的免疫細胞因子結合了靶向細胞外基質（ECM）成分的抗體，特別是與疾病相關的纖維連接蛋白亞型。其中一種抗體名為F8，識別纖維連接蛋白的額外結構域A，它在炎癥部位的新生血管中高表達，但在大多數健康組織中檢測不到。F8的幾種細胞因子融合蛋白已在癌癥的臨床前和臨床上取得了成功。

另一種ECM靶向抗體稱為L19，它與纖維連接蛋白的額外結構域B結合，從而能夠選擇性定位到腫瘤相關血管。最近，包含TNFα、IL-12或IL-2的L19單鏈抗體融合蛋白已證明具有抗腫瘤功效。目前，L19-TNFα、L19-IL12和L19-IL2正在臨床試驗的各個階段進行探索，作為單一療法或與其他癌癥療法聯合。

另一種腫瘤靶向策略是利用壞死腫瘤區域中發現的游離DNA片段。例如，結合組蛋白的人lgG1抗體NHS76與IL-12融合，以增強腫瘤定位。NHS-IL12與放療、化療、癌癥疫苗或免疫檢查點抑制具有協同作用，顯示了其在聯合治療方法中的治療潛力。在第一階段臨床試驗中，發現NHS-IL12具有良好的耐受性和免疫刺激性。目前，集中于將NHS-IL12與其他癌癥治療相結合的聯合療法。

其他免疫細胞因子融合方式也被用于向TME靶向輸送促炎細胞因子。對于其中許多方法，降低了細胞因子的親和力來確保抗體靶向而不是細胞因子指導融合蛋白的定位。例如，PD-1抗體與親和力受損的IL-21變體融合，以將IL-21傳遞給PD-1表達的T細胞，同時最小化對局部抗原提呈細胞的非靶向影響。

炎癥靶向的細胞因子抗體融合蛋白

由于其固有的炎癥部位定位，ECM靶向抗體也被用于將抗炎細胞因子活性導向慢性炎癥和自身免疫性疾病的炎癥部位。

在最近的進展中，包含IL-4、IL-9、IFN-α和IL-10的新型免疫細胞因子已在臨床前用于治療慢性炎癥和自身免疫性疾病。在膠原蛋白誘導的關節炎小鼠模型中，F8-IL4與地塞米松聯合使用，可完全治愈該疾病。在實驗性肺動脈高壓小鼠模型中，F8-IL9-F8降低了右心室收縮壓并改善了超聲心動圖參數。

作為基于ECM靶向的替代方法，以Clec9A為靶向的單域抗體成功地將IFN-α活性定位到Clec9A+DC，從而改善多發性硬化癥小鼠模型的癥狀，而沒有與可溶性IFN-α相關的毒性。在另一項研究中，融合到Fc結構域的抗CD86單鏈抗體與IL-10的融合蛋白誘導了CD86+耐受性DC的分化，可用于治療移植物抗宿主病（GVHD）。

信號偏向性細胞因子抗體融合蛋白

結構導向分子工程的發展促進了有偏向性的細胞因子設計，這些免疫細胞因子可以調節整合細胞因子的活性。其中IL-2是目前研究最活躍和最領先的免疫細胞因子。

由于IL-2在協調免疫反應中的重要作用，它已被用于治療癌癥和自身免疫性疾病。IL-2可以通過IL-2Rβ和γC鏈的異二聚體受體或IL-2Rα、IL-2Rβ和γC鏈的更高親和力的三聚體受體傳遞信號。與效應T細胞相比，Tregs高表達IL-2Rα，因此對IL-2具有極高的敏感性。Boyman等人開發了一種抗IL-2的抗體（S4B6），選擇性地將IL-2活性導向效應細胞。S4B6抗體使IL-2活性偏向于效應細胞的擴增，IL-2/S4B6復合物在小鼠中具有強大的抗腫瘤活性，而不會引起全身毒性。另一種IL-2的抗體JES6-1誘導小鼠優先Treg的擴增，IL-2/JES6-2復合物用于治療I型糖尿病和其他自身免疫性疾病。

IL-2的突變也可以產生偏向性，可與針對疾病抗原的抗體融合。例如，將IL-2突變后去除了與IL-2Rα的結合能力，然后融合到抗癌胚抗原（CEA）抗體，CEA-IL-2v抑制了腫瘤生長并提高CEA+荷瘤小鼠的存活率。此外，在CEA+結腸癌小鼠模型中，發現CEA-IL2v與CEA靶向嵌合抗原受體（CAR）T細胞協同誘導腫瘤完全根除，并產生保護性免疫。另一融合蛋白用突變IL-2取代抗EGFR抗體的一個Fab臂，突變IL-2降低了IL-2Rα結合活性，由此產生的分子抑制了黑色素瘤小鼠模型中的腫瘤生長。

細胞因子的結構阻滯或“掩蔽”也可以改善偏向性。例如，效應細胞偏向的IL-2變體和IL-2Rβ細胞外結構域（ECD）分別融合到Fc結構域，使得IL-2Rβ鏈結合并“遮蔽”融合的IL-2，其通過可切割連接子連接到各自的Fc結構區。因此，在腫瘤相關基質金屬蛋白酶存在的情況下，選擇性地釋放掩蔽的IL-2，使該分子表現出優于IL-2的療效，并與檢查點阻斷療法產生強大的協同作用。

免疫毒素（RIT）抗體融合蛋白

RIT是免疫毒素與抗體片段的融合，RIT的抗體部分發揮導向作用，將毒性有效載荷靶向患病細胞。毒性成分可按其細胞毒性機制分類：穿孔毒素（PFTs）；核糖體失活蛋白（RIPs）和微管破壞蛋白（MDPs），它們阻止有絲分裂和囊泡轉運，從而促進細胞凋亡。

RIPs是RITs中使用的最多樣化和最廣泛的毒素類別，而MDPs是最少的。這兩種類型都需要RIT的抗體部分，以促進內吞作用，從而實現細胞殺傷。相比之下，大多數PFT直接與細胞膜結合，因此不需要抗體介導的內吞作用來發揮細胞溶解功能。

目前正在臨床試驗或經FDA批準的RIT都是RIPs，包括銅綠假單胞菌外毒素A（PE）、白喉毒素（DT）和志賀毒素1（Stx1）。兩種臨床上最領先的RIT，moxetumomab pasudotox（LUMOXITI?）和oportuzumab monatox，均含有優化后的PE。在臨床試驗中有幾個分子使用DT作為有效載荷，被優化用于RIT。此外，只有一個Stx1有效載荷RIT正在臨床試驗中。RIT面臨的一個重大挑戰是，許多患者產生了針對毒性部分的抗抗體，從而嚴重阻礙治療效果。此外，由于大多數RIT無法充分穿透實體腫瘤，許多免疫毒素的大小限制了其在腫瘤學中的臨床應用。

到目前為止，絕大多數研發和優化工作都集中在外源毒素上，但顆粒酶B和顆粒溶素等內源性RIP毒素最近已經在臨床前開發，并且由于它們沒有免疫原性，因此極具吸引力。另一種RIT方法是針對腫瘤的改良超抗原（SAg）。與其他直接破壞細胞功能的毒素不同，SAgs招募并激活T細胞以殺死靶細胞。總的來說，RIT在有針對性地消除癌細胞方面顯示出巨大的前景。

抗體導向酶前體藥物治療（ADEPT）是另一種新型策略，在該策略中，連續給予以癌癥為靶點的抗體酶融合蛋白和酶激活前體藥物。與大多數RIT相比，ADEPT融合蛋白中的抗體不觸發受體介導的內吞作用，因為酶必須留在細胞外才能獲得前體藥物。由CEA特異性抗體片段和細菌羧肽酶G2（CPG2）組成的融合蛋白MFECP1，在早期臨床試驗中顯示出良好的安全性并局限于患者腫瘤，但免疫原性是一個問題。ADEPTS的臨床前開發仍在繼續，但臨床轉化需要克服免疫原性挑戰。

抗體酶融合蛋白是另一類已進入臨床試驗的新型分子，這些融合蛋白中的抗體有助于將酶有效載荷運輸到溶酶體，在溶酶體中，它們取代已突變的酶來治療遺傳疾病，如龐貝病和粘多糖病。一種抗體融合蛋白VAL-1221將抗體介導遞送技術與重組人類酸性α-葡萄糖苷酶（rhGAA）相結合，促進將rhGAA遞送至肌肉，降解從溶酶體泄漏的糖原。目前，VAL-1221正在進行臨床開發用于治療晚發性龐貝氏癥患者。

其他抗體酶融合蛋白，例如HIRMAb酶融合蛋白，除了促進通過人類胰島素受體（HIR）的內吞作用外，還促進跨血腦屏障的轉運。這些分子在臨床前研究以及早期臨床試驗中均顯示出良好的前景。

小結

基于抗體的融合蛋白已顯示出非凡的臨床價值，創新的分子修飾、融合形式和臨床前開發中蛋白質有效載荷的爆炸性增長都預示著抗體融合蛋白的進一步迅猛進展。基于抗體的靶向性可以顯著提高有效載荷的效力，并防止不良副作用。與抗體融合的蛋白質有效載荷也表現出腎清除率降低和循環半衰期延長，減少了重復給藥的需要。

目前，臨床上研究最領先的分子主要專注于腫瘤學應用，但基于免疫細胞因子和RIT的感染性、慢性炎癥和自身免疫性疾病的治療肯定很快就會出現。用于治療神經系統疾病和遺傳性退行性疾病的抗體融合蛋白相信也即將出現。抗體融合蛋白治療的前景廣闊。