2019新型冠狀病毒Nanopore測序標準操作流程-PCR擴增測序版簡介
新近在武漢出現的新型冠狀病毒引發的肺炎疫情引起了社會各界的極大關注。對新型冠狀病毒進行測序不僅能夠為病原鑒定、病毒溯源與變異、傳播力和傳播機理等研究提供切實可靠的基因組信息，還能夠為識別病毒傳播方式和確定暴發范圍提供重要的線索，為及時完善防控策略和措施奠定完善的理論基礎。
MinION測序儀由于其長讀長、可移植性強、可實時訪問測序數據且具有非常低的初始成本，因此在許多臨床情況下越來越多地用于對各種病毒病原體進行測序。尤其在新冠肺炎診療方案（試行第五版）中，病例確診采用“逆轉錄酶聚合酶鏈反應 （RT-PCR）”核酸檢測與基因測序兩種方式，可見在新冠肺炎核酸與抗體檢測等方法還不完善時，臨床急需MinION這樣的小規格設備對新型冠狀病毒進行實驗室或現場快速檢測。雖然Oxford Nanopore 的技術專家們正在積極與納米孔社區的科學家通力合作，支持開發對新型冠狀病毒測序的最佳實踐和實驗方案，但是，缺乏關于新型冠狀病毒基因組的MinION測序的詳細步驟。
ARTIC Network是一個旨在為病毒爆發開發方案，提供實時的流行病學信息以供公共衛生機構判斷并采取行動的項目。由包括牛津大學、劍橋大學和愛丁堡大學在內的多所大學聯合組成。ARTIC network 發布了一套可協助研究人員測序新型冠狀病毒2019-nCov的實驗材料，包含引物設計、實驗方案、生信學教程和數據庫 （https://artic.network/ncov-2019 ）。
在整理ARTIC network發布的測序流程基礎上，還整合了北京市衛健委、北京協和醫院-2019新型冠狀病毒核酸檢測標準操作流程。希望這個詳盡的中文流程能夠為新型冠狀病毒的各項攻關任務提供參考，并對抗擊疫情的第一線提供切實有效的幫助，使更多研究者能夠更快速地把研究成果應用到戰勝疫情中。
本流程使用的試劑盒、耗材參考如下：
目 錄
操作區域：應在基因擴增實驗室潔凈區或普通實驗室的清潔區。
1. 戴一次性帽子
2. 戴醫用N95口罩, 檢查口罩密閉性
3. 穿一次性防護服
4. 穿一次性鞋套
5. 穿一次性防水靴套
6. 戴第一層乳膠手套,檢查手套密閉性
7. 檢查隔離衣的舒適性, 通過下蹲等動作，已達到核酸檢測和防護要求
8. 穿外層一次性隔離衣, 有條件時加穿、由他人協助完成
9. 戴防護目鏡
10. 戴第二層乳膠手套, 檢查手套密閉性
注: 穿戴完畢后，盡快穿過專用緩沖間或走廊進入核酸提取區或專用的核酸提取實驗室。
操作環境：核酸提取和加樣實驗室
注：需由2名工作人員進入核酸提取和加樣實驗室。生物安全柜內應配備吸水棉及消毒酒精（有條件可配吸水臺布，已備樣本溢撒處理）
1. 打開二級容器，用75%酒精消毒樣本密封袋外表面并檢查樣本管密閉性
2. 滅活條件：56℃，30分鐘(可用水浴等多種方式)
3. 取出滅活樣本管，酒精擦拭外表
4. 樣本放入到生物安全柜內
操作環境：第一步環境為試劑配制區或另一件單獨的潔凈區，第二、三步環境為核酸提取和加樣實驗室。
注：本過程使用QIAGEN Viral RNA Mini Kit進行，操作環境為進入試劑配制區或另一件單獨的潔凈區
1、試劑配制區準備：AW1、AW2、Carrier RNA
1.1 在AW1中加入無水乙醇130mI
1.2 在AW2中加入無水乙醇160mI
1.3 在310ug Carrier RNA中加入310ul AVE，顛倒混勻使其充分溶解
1.4 完成AW1、AW2、Carrier RNA配制
后通過傳遞窗傳遞到樣本處理區或由專人送到核酸提取實驗室
2、樣本的裂解
2.1取消毒無菌的1.5mL EP管
2.2取560ul AVL裂解液
2.3加入5.6ul Carrier RNA，在AVL裂解液中加入
2.4加入140ul 待測樣本，已滅活待提取樣本
2.5渦旋振蕩15秒
2.6室溫靜置10分鐘，裂解樣品
2.7將EP 管放入離心機內瞬時離心，去處可能殘留在EP 管蓋上的裂解產物，防止污染
2.8加入560ul 無水乙醇
2.9渦旋振蕩15秒
2.10將EP 管放入離心機內瞬時離心，去處可能殘留在EP 管蓋上的裂解產物，防止污染
3、提取核酸
3.1向離心柱加入裂解產物630ul
3.2 8000轉離心1分鐘，若離心機等設備在生物安全柜之外，離心管每次進出需對離心管外表面消毒
3.3更新廢液收集管，小心取出離心柱，將上層離心柱轉移到新收集管中
3.4將剩余約630ul 裂解產物加入離心柱，若樣本體積提取大于140ul 時，重復此步驟直至所有產物離心
3.5 8000轉離心1分鐘，小心將離心柱轉移到新收集管中
3.6取500ul AW1加入離心柱中，請將吸頭接觸離心柱內壁緩慢加樣，8000轉離心1分鐘，小心將離心柱轉移到新收集管中
3.7取500ul AW1加入離心柱中，8000轉離心1分鐘，小心取出離心柱，更換新收集管
3.8取500ul AW2加入離心柱中，14000轉離心3分鐘小心取出離心柱，更換新收集管
3.9離心機最大轉速，離心1分鐘，確保將AW2殘液離心干凈
3.10取無菌1.5mL EP管收集核酸，將離心柱小心放入1.5mL EP管中
3.11取40-60ul AVE加入離心柱上，AVE 洗脫液盡量全部覆蓋離心柱膜，用EP 管蓋蓋住離心柱
3.12用無菌剪刀剪去原離心柱管蓋，室溫靜置1分鐘
3.13 8000轉離心1分鐘，回收核酸，丟棄離心柱，獲得提取核酸，做好標記
1.準備提取試劑，按相關說明書
2.加入200ul 滅活樣本
3.上機提取核酸
4.提取完成，回收核酸
1、配制PCR反應體系
注：進入試劑配制區或另一件單獨的潔凈區，以某牌試劑為例（總25ul 體系），按說明書配制
1.1根據檢測數量配制體系
1.2充分混勻及離心
通過傳遞窗傳遞到樣本處理區或由專人送到核酸提取實驗室
2、加入核酸和對照
操作環境為：核酸提取和加樣實驗室
2.1每孔分裝20ul 反應體系
2.2各孔分別加入5ul 待測樣本核酸或陰陽性對照，每次檢測需包含1個陽性對照和3個陰性對照，且陰性對照隨機分布
2.3密封PCR管，有條件時模板加樣在單獨生物安全柜內
將配好的PCR管通過傳遞窗送入擴增區或由專人單獨送入單獨的PCR擴增區
操作環境：進入PCR擴增區或另一件單獨的擴增專用實驗室
1.從傳遞窗取出PCR反應管
2.上機前混勻、離心反應體系
3.按試劑盒說明書設置擴增參數并分析判讀結果
注：結果分析時，認真閱讀試劑盒說明書，了解試劑盒靈敏度等性能指標和方法學局限性基礎上，結合本次實驗結果陰陽質控狀況，綜合判讀結果
4.反應后PCR管應裝入密封袋后立即放入制定垃圾桶，為防止擴增污染、反應后PCR管嚴禁開蓋
1.樣本處理完成后：
用75%酒精消毒處理外層手套并脫下外層手套放入生物安全柜內垃圾桶中
2.檢測完成后
2.1 0.5%-1%有效氯消毒液或75%乙醇擦拭工作臺面及地面
2.2將安全柜內產生的醫療垃圾用三層垃圾袋密封
2.3將新冠檢測醫用垃圾放入指定垃圾桶
2.4垃圾袋上標記醫療垃圾信息
3.實驗結束后：
3.1生物安全柜和實驗室空間，紫外照射消毒，時間至少30分鐘
3.2工作人員：0.5%-1%有效氯消毒液或75%乙醇，均勻噴霧消毒一次性隔離衣，他人協助；脫去一次性隔離衣，放入新冠檢測醫用垃圾指定垃圾桶
注：工作人員離開二級實驗室后，在緩沖區或走廊按順序摘脫個人三級防護用品
4. 摘脫個人三級防護用品
4.1戴新外層手套
4.2摘護目鏡，并置于75%乙醇中消毒浸泡
4.3脫一次性防護服
4.4脫外層手套
4.5摘N95一次性口罩
4.6摘一次性帽子
4.7脫一次性鞋套
4.8脫手套
注：防護服及醫療垃圾均需進行高壓處理
5. 垃圾處理
5.1高壓前后醫療垃圾嚴格區分
5.2 121℃，30分鐘 濕熱高壓處理
5.3取出濕熱后垃圾，高壓試紙變色為有效
5.4已高壓后醫療垃圾作為普通醫療垃圾處理
注：本流程使用到的試劑盒為Nanopore LSK109，即連接測序試劑盒（Ligation Sequencing Kit），提供靈活的方法，可使用dsDNA樣本（比如，gDNA，cDNA或擴增子）來構建測序文庫。
構建文庫方法：通過使用NEB Next末端修復/加dA尾模塊試劑盒（NEB Next End Repair/dA-tailing module）來進行DNA末端修復和dA尾添加，然后把試劑盒中提供的測序接頭連接到制備好的DNA末端。
獲取病毒RNA樣品后，主要過程為逆轉錄，PCR擴增引物見https://github.com/artic-network/artic-ncov2019/tree/master/primer_schemes/nCoV-2019/V1，為不同樣品添加“Barcode”，加接頭序列，然后建庫上機。
注：此步驟主要目的為將病毒RNA樣品逆轉錄成DNA，來源人臨床樣本的病毒RNA，作為測序樣品，其Ct值應在18-35；若其Ct值在12-15，則應使用水將樣品稀釋100倍；若其Ct值在15-18，則應使用水將樣品稀釋10倍。
1.1 取從樣品中提取出來的RNA樣品，配制混合體系于0.2ml 8連排PCR管中：
1.2 使用移液槍輕輕混合液體，然后，使用掌上離心機短暫離心。
1.3 按以下條件，孵育反應體系：
1.4 將以下反應物添加到退火的模板RNA中：
1.5使用移液槍輕輕混合體系，后使用掌上離心機短暫離心。
1.6在以下條件，孵育反應體系：
對未知序列的樣品測序時，應用隨機引物對DNA樣品進行PCR擴增，即為隨機引物PCR。
2.1 將提前設計好的凍干粉引物用Nuclease-free Water制成100uM；
2.2 通過取每對引物5μl添加到1.5ml標有“ Pool 1(100μM)”或“ Pool 2(100μM)”的Eppendorf EP管中來生成引物庫，其總體積應為490 μl；
2.3 使用Nuclease-free Water以1:10的比例稀釋該引物庫，以生成10μM的引物儲備液；為了防止意外的污染或者降解，建議將引物庫進行等分稀釋保藏；注意：每種引物在反應體系中的終濃度應為0.015μM。在這種情況下，兩個引物庫中都有98個引物，因此25μL反應體系需要3.6μL引物庫(10uM)。對于其他方案，請適當調整添加的體積。
2.4 配制以下反應體系于200ul 8連排PCR管中：
Lot. M0493S, NEW ENGLAND
2.5 向每個試管中加入2.5 μl cDNA，使用移液槍將其充分混勻。
2.6 使用掌上離心機短暫離心。
2.7 按如下條件設置：
注：使用PCR儀進行加熱反應，若需要設置熱蓋溫度，建議熱蓋溫度高于反應的最高溫度，防止冷凝水形成；PCR反應的循環數與樣品RNA的Ct值相關，Ct值為18-21，循環數可設置為25；Ct值為35時，達到最多循環數35。
2.8 將每個樣品對應的“Pool 1”和“ Pool 2”兩個 PCR反應的反應體系合并到一個1.5 ml Eppendorf EP管中。
注：以上14步反應應在“RNA專用超凈臺或生物安全柜”中進行，操作前應使用酒精擦拭，并紫外照射殺菌。
按以下步驟純化反應體系：(本純化過程使用AMPure XP磁珠進行)，此步仍在上述提到的“RNA專用超凈臺或生物安全柜”中進行，避免樣品RNA的降解和污染。
3.1提前半小時將磁珠室溫孵育，使用渦旋震蕩儀徹底震蕩AMPure XP磁珠，確保其混合均勻，溶液應為均勻的棕色；
3.2將等體積（1:1）的AMPure XP磁珠添加到樣品管中，并通過輕彈或移液輕輕混合。例如，將50 μl AMPure XP磁珠加入50 μl反應體系中；
3.3使用掌上離心機短暫離心；
3.4室溫孵育5 min；
3.5將試管轉移到磁力架上，靜置2 min，至磁珠被吸引到磁力架一側或混合液變澄清；
3.6小心棄上清液，注意不要接觸磁珠；
3.7向沉淀中加入200 μl室溫放置70％乙醇溶液；
3.8片刻后，小心地除去并丟棄乙醇，注意不要接觸磁珠；
3.9跳到3.7，使用70％乙醇二次清洗除雜；
3.10用掌上離心機短暫離心，用移液器小心棄去殘留的液體，避免接觸磁珠；
3.11打開試管蓋，靜置1min，或直到沉淀磁珠表面失去光澤(如果沉淀完全干燥，它將破裂并變得難以重懸)；
3.12將沉淀的磁珠重懸于30 μl洗脫緩沖液(EB)中，用手指輕彈或使用移液槍輕輕混合，后放在磁力架上孵育2min，至磁珠被吸引到磁力架一側或混合液變澄清；
3.13將上清液轉移到干凈的1.5mL EP管中，確保沒有磁珠轉移到該管中；
3.14取1 μl 樣品使用Quantus? Fluorometer或Qubit?進行熒光定量。
使用Quantus? Fluorometer/ Qubit?對樣品進行熒光定量：如果樣品濃度大于25 ng/μL，則通過添加270 μL 10mM Tris將樣品稀釋10倍，并使用Quantus?/ Qubit?熒光計再次定量。
4.1從冰箱中取出Lambda DNA標準溶液(400 ng/μL)，放在冰上融化備用。從冰箱中取出ONE dsDNA Dye solution，室溫融化備用；
4.2取兩個用于校準的0.5 ml EP管，分別標記為“Blank”和“Standard”；
4.3 每個試管中加入200 μl ONE dsDNA Dye solution；
4.4使用移液槍混勻Lambda DNA標準溶液，并且加1 μl至“Standard”管中；
4.5使用渦旋震蕩儀劇烈混合5 s，然后使用掌上離心機短暫離心；
4.6室溫孵育2 min；
4.7選擇“Calibrate”，選擇“ONE DNA”，后將“Blank”樣品放入儀器中，選擇“Read Blank”。然后，將“Standard”放入閱讀器，然后選擇“Read Std”；
4.8準備好為所有樣品進行熒光定量的0.5 ml EP管；
4.9在蓋子上標記EP管，避免在EP管的側面做標記，造成干擾樣品讀數；
4.10在每EP管中加入199 μl ONE dsDNA dye solution；
4.11加1 μl樣品到對應的EP管中；
4.12使用vortexing（渦旋震蕩儀）劇烈混合樣品5s，用掌上離心機短暫離心；
4.13室溫孵育2min；
4.14在Quantus? Fluorometer的主屏幕上，選擇“Protocol”，然后選擇“ONE DNA”作為測定類型；
4.15在主屏幕上，將“樣品量”設置為1 μl，“單位”為ng/μL；
4.16把第一個樣品放入熒光計中，關閉蓋子，樣品濃度自動顯示在屏幕上。按此操作檢測其余樣品；
4.17屏幕上顯示的值是dsDNA濃度（以ng/μL為單位），將所有結果仔細記錄在電子表格或實驗室筆記本中。
注：為不同的實驗樣品添加接頭（Barcode），即為不同的樣品加上標簽，如果你只有一個實驗樣品則可以省略此步。如果你有兩個以上的樣品，通過添加不同的標簽，使不同樣品間相互區分，則可以一起進行測序反應，節省了測序時間和成本。
5.1為每個樣品準備好一個1.5m EP管；
5.2通過將每個樣品稀釋為1ng/ul來標準化樣品濃度；
5.3為不同樣品添加其對應的“二維碼”即“native barcoding”。
5.3.1每個樣品配制如下反應體系：
5.3.2 按如下條件孵育反應體系：
5.3.3將以下反應物直接添加到之前的反應體系中：
注: 在這里，每一個樣品都可以使用EXP-NBD104（1-12）和EXP-NBD114 （13-24）中包含的所有Barcode，在“一個樣品文庫”中可以使用6-24個Barcodes，使Nanopore芯片達到最大的產能。
5.3.4按以下條件孵育反應體系：
5.3.5將上述所有反應體系轉移到一個新的1.5 ml EP管中；
5.3.6上述樣品進行熒光定量：步驟參考步驟4；
5.3.7按如下體系配制AMII接頭蛋白連接體系：
5.3.8室溫孵育15min；
5.3.9按照1:1的比例向樣品管中加入AMPure XP磁珠，使用手指輕彈或用移液器輕輕混勻。注：提前半小時將磁珠室溫孵育，使用前徹底渦旋AMPURE XP磁珠以確保將其充分重懸，溶液應為均勻的棕色；
5.3.10使用掌上離心機短暫離心；
5.3.11室溫孵育5 min；
5.3.12將試管轉移到磁力架上，靜置2 min，至磁珠被吸引到磁力架一側或混合液變澄清；
5.3.13小心棄上清，注意不要接觸磁珠；
5.3.14加入200 μl SFB，并通過移液器混合將磁珠完全重懸；
注：SFB將去除多余的接頭蛋白而不會接頭蛋白-RNA復合物。請勿使用在早期清理中用到的70％乙醇。
5.3.15使用掌上離心機短暫離心；
5.3.16除去上清液并丟棄；
5.3.17重復步驟14-16進行SFB二次清洗；
5.3.18使用掌上離心機進行短暫離心以去除多余的SFB溶液；
5.3.19加入15 μl EB溶液，并使用移液槍重懸磁珠；
5.3.20室溫孵育2 min；
5.3.21放置于磁力架上，靜置2 min，待磁珠被吸引至靠近磁力架的一側或溶液變澄清；
5.3.22轉移最后的上清液到一個新的1.5 mL EP管，此樣品即為建庫結果。
5.4 使用Quantus? Fluorometer進行熒光定量（步驟4）。
注：如果需要，最終文庫可以在4°C的10 mM Tris pH 8/EB中保存長達一周，或者可以直接進行MinION測序。
致謝：北京金果殼公司張工和邵經理、課題組金玉和33同學。
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