野生型的操縱子以被調節的方式進行表達,調節系統若發生突變可能使表達停止或者在沒有誘導物存在時仍然表達。前者稱為不可誘導性(uninducible)突變;后者對調節沒有反應能力,無論誘導物是否存在都進行表達,故稱為組成型突變(constitutive mutants)。
操縱子調節系統的成份通過突變已被鑒別出來,它們作用于結構基因的表達以及編碼區的外側序列。這些成份分為二類:以啟動子和操縱子,作為調節蛋白(RAN聚合酶,阻遏物)靶順序的通過順式作用突變而被鑒定出來。lac位點通過反式作用突變被鑒定是為編碼阻遏蛋白的基因。
操縱基因是原來通過組成型突變鑒別出的,稱為“Oc”,其分布特點提供了第一個順式元件的證據,它是有功能的,但本身不編碼。與OC突變相鄰接的結構基因以組成型表達,這是由于突變改變了操縱基因,使阻遏蛋白不能與之結合。這樣阻遏蛋白就不能阻止RNA聚合酶起始轉錄。從而使操縱子持續轉錄。
操縱基因只控制與它相鄰接的一些lac基因。若將第二個Lac操縱子導入細菌的質粒上,它有自己特有的操縱基因。操縱基因互不干擾。因此如果一個操縱子有一個野生型的操縱基因,在通常條件下,它將被阻遏。當第二個操縱子帶有OC突變時,它將持續表達。
這些特點表明操縱基因是一個典型的順式作用位點。操縱基因只控制與其相鄰接的基因而不影響存在于細胞中的其它DNA上的等位座位。像OC這樣的突變稱為順式-顯性(cis-dominant)。順式作用位點中發生突變就不能和相關蛋白相結合,當兩個順式作用位點彼此靠得很近時(如啟動子和操縱基因),我們通過互補測驗是不能分別突變發生在那一個位點上,而只有通過它們對表型的影響來加以區別。順式顯性是控制鄰接順序的那些DNA位點的特性。如果一個控制位點其功能是作為多順反子mRNA的一部分。它將表現出順式顯性的特點。特別表現在控制位點不能和被它調節的基因相分離。從遺傳學的觀點來看這些位點和基因是在DNA上還是在RNA這并不重要。
lacI-突變型也可導致持續轉錄。無論是點突變還是缺失都可產生這樣的結果。后者可能是丟失了和DNA結合的功能區。因此與誘導物是否存在無關。這種現象是符合負控制系統的。lac+基因編碼一個阻遏蛋白,它可以關閉lacZYA的轉錄。阻遏蛋白失去和操縱基因結合能力時,則為組成型突變。轉錄能在啟動子上自由地起始。同時lacI- 突變由于阻遏蛋白的失活使lacZYA呈組成型表達。
當lacI- 和lacI+二者同時存在于同一個細胞時,通過確定二者的關系可以幫助人們得出正確的結論。這只能通過構建部分二倍體(partial diploid)來完成的。即一個拷貝的操縱子位于細胞的主染色體上,而另一個放在質粒上,此質粒僅帶少量基因,可以獨立復制。
在細胞中若既有lacI+又有lacI-,則可以正常調節。當除去誘導物時,結構基因又重新被阻遏。這表明lacI+可以產正常的阻遏物,當誘導物不存在時它可以反式阻遏lacI ZYA+基因,按遺傳學的觀點野生型的可誘導性對于組成型突變型是顯性的。這是負控制的重要標志。
操縱子非誘導性突變不能都得到表達,它們可以分成兩種組成型突變:(1) 啟動子突變是順式作用,若這種突變阻礙了RNA聚合酶與Plac的結合,也就不能閱讀操縱子,因為它不能轉錄。(2) lacI突變若阻遏物失去和誘導物結合的能力也會導致和前者相同的現象。這種突變稱為lacIs。
這種反式作用對野生型來說是顯性的。阻遏蛋白被保持在對操縱基因的識別和阻礙轉錄的這種活性狀態中。誘導物是否加入對其沒有影響。這是由于細胞中突變的阻遏物結合在所有的lac操縱基因上并阻斷轉錄,同時還不能取下,野生型阻遏物的存對它也毫無影響。
lacI突變的特點可以從阻遏蛋白結構的得以解釋。在阻遏蛋白上具有兩種不同類型的結合位點。通過這些結合位點來控制基因的表達以對環境作為反應。DNA-結合識別操縱基因。誘導結合位點與小分子誘導物結合。一旦與誘導物作用使其構象發生改變而失去與操縱基因DNA結合的能力。通過lacI突變失去某些活性可以鑒別出阻遏物亞基中的兩個結合位點。DNA-結合位點的突變是組成型的(因為阻遏物不能和DNA結合來阻斷轉錄)。誘導物結合位點的突變是不可誘導性的(由于誘導物不能減少阻遏物和DNA的親和力)。
阻遏物功能的一個重要的特點是多聚體蛋白。在細胞中阻遏蛋白的亞基隨機結合成四聚體。當不同的lacI等位基因存在時,它們的產物作為亞基結合成異聚四聚體,其特性和同聚四聚體不同。這種亞基之間的作用類型是具有多聚體蛋白的性質,被稱為等位基因間的互補(interallelic complementation)。
負的互補(negative complementation)發生在某些阻遏蛋白突變體之間。正如在lacI-d與lacI+基因的重組中所見到的一樣。此lacI-d的突變僅導致阻遏蛋白不能和操縱基因結合。因此它像lacI-等位基因一樣,使操縱子呈組成型表達。由于lacI-類型的突變產生的阻遏物沒有活性,它相對于野生型基因是隱性的,而“-d”這個符號表示負互補這種突變類型是顯性的。這種突變稱反式顯性(trans-dominant),也稱為顯性失活(dominant negatives)。
這種顯性的原因是由于lacI-d等位基因產生一個“壞”的亞基不僅它本身不能結合操縱基因的DNA,而且它還通作為四聚體的一部分阻止四聚體中“好”的亞基與DNA結合。這就意味著阻遏蛋白四聚體是作為一個總體,而不是單個單體的簡單的集合。這對完成阻遏來說是很必要的。在體外將“好”的亞基和“壞”的亞基混合起來也會產生損壞的作用。
lacI-d的突變是發生在阻遏蛋白的DNA結合位點這就可以解釋混合的四聚體可以阻止與操縱基因的結合。結合位點數目的減少使四聚體和操縱基因的親和力減少。lacI基因的左末端對于蛋白產物來說正好是在N-末端DNA-結合位點。lacI-隱性突變發生在此位點以外的任何區域。但可以起到DNA結合的間接作用。
lacIs是不可誘導性突變,它是不能對誘導物作出反應。此可能由于阻遏蛋白失去了誘導物結合位點,或者不能將它們的作用傳遞到DNA-結合位點。lacIS突變位點是很有規律的延著基因成束間隔排列。這些間隔可能存在著肽鏈的改變。
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R P O Z Y A
①Z、Y、A是指結構基因,用于表達性狀;
lacZ編碼β-半乳糖苷酶,它可以切斷乳糖的半乳糖苷鍵,而產生半乳糖和葡萄糖;
lacY編碼β-半乳糖苷透性酶,它構成轉運系統,將半乳糖苷運入到細胞中;
lacA編碼β-半乳糖苷乙酰轉移酶,只將乙酰-輔酶A上的乙酰基轉移到β-半乳糖苷上;
②I是指調節基因,調節分泌阻遏物或誘導物;
③O是指操縱基因,與阻遏蛋白的結合部位;
④P是指啟動子,啟動基因的轉錄和翻譯。