改良微量凱氏定氮法測定血清蛋白質總量

實驗概要

改良微量凱氏定氮法測定血清蛋白質總量

實驗原理

        蛋白質是機體內主要的含氮物質，而且氮元素的含量相當恒定，一般為16％，其它非蛋白質的含氮化合物所占的氮量甚微。因此，測定生物樣品的含氮量，即可推算蛋白質含量。

        測定生物樣品中的含氮量，最常用的方法是凱氏定氮法，本實驗采用改良微量定氮法，其原理是：

1. 氧化并固定有機氮質（消化）：以強氧化劑（濃硫酸，亞硒酸）與稀釋血清混合加熱、消化，血清中的有機物質全部分解，大部分氧化逸出（如CO2↑、SO2↑、H2O↑），氮則以（NH4）2SO4形式被固定下來。

2. 顯色、比色：硫酸銨與堿性的納氏（Nessler）試劑作用，生成棕色膠體溶液，然后與用同樣方法處理的標準硫酸銨溶液比色，計算血清總氮量。

　　（NH4）2SO4＋2NaOH——→Na2SO4＋2NH4OH

　　2NH4OH＋2（KI2）?HgI2——→NH2Hg2I3＋4KI＋NH4I＋2H2O

　　　　　　碘化鉀汞雙鹽　　　　       碘代雙汞胺

3. 血清中含有非蛋白質的含氮化合物（如尿素、尿酸、肌酐、肌酸、氮、氨基酸等），其中所含的氮稱為非蛋白氮（Non protein nitrogen）通常簡寫為N．P．N。測定時需先將血清制備成無蛋白血濾液、再經消化、顯色、比色即可測知血清非蛋白氮含量。本實驗采用鎢酸法制備無蛋白血濾液，其原理為鎢酸鈉與硫酸作用生成鎢酸，后者使蛋白質沉淀，過濾可得無蛋白血濾液

　　Na2WO4＋H2SO4——→H2WO4＋Na2SO4

4. 血清總氮量減去非蛋白氮量即為蛋白質含氮量，根據蛋白質含氮量為16％，即可將氮量換算為蛋白質量。

實驗步驟

1. 制備無蛋白血濾液：用移液管吸取血清0.50m1，置于中試管中。加蒸餾水4.00ml混合，再加10％鎢酸鈉0.25ml，混勻，然后加入2/3 N H2SO4 0.25ml。隨加隨搖，靜置5分鐘后過濾，濾液必須無色透明，否則需重過濾或再制備。

2. 稀釋血清：用移液管吸血清0.25ml置于50ml容量瓶中，加生理鹽水至刻度，顛倒混合數次以保證充分混勻。

3. 消化：準確吸取稀釋血清和無蛋白濾液各1.00ml，分別置于2支硬質試管中，加消化液0.20ml，混勻，加入玻璃珠1粒，用木夾夾住試管，于酒精燈上先均勻加熱，然后把試管豎直，于管底部加熱煮沸后，消化5~8分鐘（注意調節玻璃管與火焰之間的距離，以使管內液體保持沸騰，而又必須防止液體外濺，否則影響測定結果的準確性）。管內液體由無色逐漸轉變為黑色，此時并有白煙充滿試管，繼續消化，傾刻間管內液體由黑色變為棕色再轉變為無色透明，即可移開或熄滅燈火。在室溫冷卻后顯色。

4. 顯色：將上述第3步消化后的兩支試管分別標明測定（u）及NPN（其中各有消化后溶液約0.1ml），并另取潔凈干試管2支，分別標明標準（S）及空白（B）按下表操作：

        充分混合后比色。顯色液必須清晰透明，不應混濁。

5. 比色：用空白管調零，以藍色濾光片或440nm波長比色，分別記錄各管光密度。

6. 計算：根據比色法原理及公式計算：

    （1）血清N．P．N含量mg/100ml

    （2）血清蛋白質含量g/100ml