在葉綠體基質（間質）中進行的不需要光直接參與的化學反應部分。在光下和暗中都能進行。暗反應可簡單概括為利用光反應中生成的 NADPH和 ATP，在一系列酶的參與下，將二氧化碳固定并還原成有機物的過程。這樣就將暫貯存于 NADPH和 ATP中的能量，轉到有機物的鍵能中。
就目前所知，二氧化碳的固定和還原的主要途徑，是卡爾文循環（又稱 C3 途徑）。該循環包括三個階段：
一是羧化階段，二氧化碳和它的接受體——核酮糖 -1， 5-雙磷酸（簡稱 Ru BP），在核酮糖 -1， 5-雙磷酸羧化酶催化下，形成 2分子的 3-磷酸甘油酸，二氧化碳被固定在其羧基上。
二是還原階段， 3-磷酸甘油酸被還原成甘油醛 -3-磷酸，所需的還原劑和能量來自光反應中形成的 NADPH和 ATP。所以，這一階段是光反應和暗反應的連接點。甘油醛 -3-磷酸是一種三碳糖，一旦二氧化碳被還原成甘油醛 -3-磷酸，光合作用的貯能過程便完成。
三、 Ru BP再生階段，利用已形成的三碳糖，經過一系列反應再生 Ru BP，又可接受二氧化碳形成一循環，這個階段所需能量也來自光反應中產生的 ATP。在有些植物中還存在著四碳雙羧酸途徑（簡稱 C4 途徑）、景天酸代謝途徑。后二途徑是碳同化的輔助途徑。暗反應主要受溫度、 CO2 濃度等因素影響。