杜氏利什曼原蟲檢查

一、目的要求

1.掌握杜氏利什曼原蟲無鞭毛體的形態特征，

2.熟悉杜氏利什曼原蟲前鞭毛體的形態。

3.了解傳播媒介白蛉。

二、實習內容

（二）玻片標本觀察

1.無鞭毛體 (染色標本) (圖2-5)

取感染了杜氏利什曼原蟲的田鼠脾臟作涂片，固定后經姬氏染色制成標本。先用低倍鏡觀察，識別正常巨噬細胞、感染的巨噬細胞以及破損的巨噬細胞的核。換高倍鏡，找到含有無鞭毛體的巨噬細胞，可見細胞內的無鞭毛體呈許多藍紫色的小點。再換油鏡觀察，可見視野中滿是由于巨噬細胞破裂而散在的無鞭毛體及巨噬細胞核。無鞭毛體呈橢圓形或圓形，大小為（2.0-5.7）μm×（1.8-4.0）μm。細胞質為淺藍色，胞質中有紫紅色的核及動基體，核大而圓，動基體為桿狀，位于蟲體的一端。

2.前鞭毛體(染色標本) (圖2-6)

取人工培養的前鞭毛體制成涂片，固定后姬氏染色。油鏡觀察，蟲體呈長梭形，長度為無鞭毛體的5倍以上。體前端稍鈍，后端尖，胞質淡藍色或淡紅色，核紫紅色，圓形，位于蟲體中央。動基體紫紅色，細小桿狀；基體在動基體前端，點狀，在體前端，由此向前伸出一根游離鞭毛。

思考：杜氏利什曼原蟲無鞭毛體的形態結構

三、視頻觀察：

1.前鞭毛體活標本 人工培養標本（見技術操作）。可見很多前鞭毛體聚集成菊花狀，鞭毛自由擺動。(視頻2-3)

2.傳播媒介（白蛉）

雌性白蛉叮咬黑熱病人時，血液或皮膚內的含無鞭毛體的巨噬細胞進入白蛉胃內，無鞭毛體發育為前鞭毛體，并以縱二分裂繁殖，數量大量增加，前鞭毛體逐漸向白蛉前胃，食道和咽部移動，一周后大量聚集在口腔及喙，當白蛉叮咬健康人時，蟲體隨白蛉唾液進入人體。

四、技術操作

1.穿刺檢查無鞭毛體

（1）髂骨骨髓穿刺：   病人側臥，暴露髂骨。根據患者年齡大小，選17～20號帶針芯的干燥無菌穿刺針，局部消毒后從髂前上棘后25px刺入，至針頭觸及骨面，慢慢地鉆入骨內約0.5～25px，拔出針芯，接上注射器，抽取骨髓。骨髓涂片，干后用甲醇固定，瑞氏染色或姬氏染色，油鏡檢查無鞭毛體。

（2）棘突骨髓穿刺： 病人側臥或跨坐椅上，暴露椎骨棘突。選最明顯棘突，局部消毒后由棘突尖垂直刺入骨髓腔，5歲以下者進針0.3～25px，5歲以上進針1.0～37.5px，拔出針芯，接上注射器，抽取骨髓。涂片染色方法同上。

（3）淋巴結穿刺: 一般在腹股溝進行。局部消毒后，左手捏住淋巴結，右手持6號針頭刺入。因淋巴結內有壓力，淋巴結內組織液可自行進入針內。稍待片刻，拔出針頭，接上注射器，將針頭內組織液涂片，同上法染色。

2.前鞭毛體培養法

(1)NNN（Novy， MacNeal， Nicolle）培養基配制   瓊脂14g，氯化鈉6g，加雙蒸餾水100ml，煮沸，充分溶解后分裝試管，每管3～5ml，用棉塞緊塞瓶口。高壓滅菌，待冷卻至48℃時，每管加入培基1/3量的無菌脫纖維蛋白兔血，混勻后斜置冷卻成斜面。每管加0.2～0.3ml洛氏液，使斜面上有一薄水層。此時，以無菌橡膠塞取代棉塞，以防水分蒸發。置37℃溫箱培育24h，確認無菌后，即可使用。
 

(2)接種培養方法   接種前，每管適量加青、鏈霉素。取病人骨髓、肝、脾、淋巴結穿刺物或皮膚活組織刮取物，與少量Locke氏液混勻，接種于NNN培養基中，置20℃～25℃溫箱培養。一般7～10天后才顯著生長。此時可取培養液涂片檢查。也有2～3周始查見前鞭毛體的，所以接種后應連續培養觀察1個月左右，再確定結果。

（3）注意事項

① 涂片用的載玻片須潔凈無油污。

② 前鞭毛體生長與溫度密切相關，須控制適宜的培養溫度。

③ 配制培養基、接種和檢查培養情況時，全程均應是嚴密的無菌操作。

思考：杜氏利什曼原診斷有哪些方法？

五、作業 （繪圖并標注內外結構）

1.無鞭毛體

2.前鞭毛體