靶蛋白通過被泛素途徑的酶E2或E3識別而被泛素化修飾，通常是通過識別靶蛋白的特定Lys殘基而將泛素連接到靶蛋白上。有時對靶蛋白的識別還需要特定位點的磷酸化并且要達到一定的磷酸化閾值。除此之外還有另外兩種識別機制，即N．end規則和一種新的區別于N．end規則的N端氨基酸殘基識別機制。N．end規則一般是針對于不穩定的蛋白質而言(若N端第一個氨基酸是Phe、Leu、Trp、Tyr、Ile、Arg、Lys和His等時此蛋白質為不穩定蛋白質)，泛素系統識別靶蛋白N端的不穩定氨基酸，然后將泛素連接到靶蛋白特定或非特定的Lys殘基的￡氨基基團上。
區別于N．end規則的N端氨基酸殘基識別機制一般是針對于某些N端并不是不穩定氨基酸殘基的靶蛋白，泛素系統識別靶蛋白N端氨基酸序列蘊涵的泛素化修飾信息從而將靶蛋白泛素化標記。對于此種識別機制，LYS殘基不是必須，靶蛋白中所有Lys殘基被剔除后仍然被泛素化修飾降解，但與野生型相比泛素化修飾率偏低；與此相對應的是N端氨基酸殘基的去除則導致此蛋白質不能被泛素化修飾。此結果說明了此種識別機制中是N端氨基酸殘基而不是靶蛋白中的Lys殘基決定了靶蛋白的泛素化修飾。
但保留靶蛋白的N端氨基酸殘基而將N端氨基酸序列中的一個或某幾個氨基酸殘基替換也會導致靶蛋白不能被泛素化修飾，此結果說明了是N端氨基酸序列而不是N端第一個氨基酸蘊涵了靶蛋白的泛素化修飾信息。通常靶蛋白的特異性是由E2或E3決定的，但發現多聚泛素鏈連接蛋t(multiubiquitinchainbindingproteins，MCBPs)可以將靶蛋白招募到蛋白酶體，并且對泛素蛋白酶系統特異性選擇靶蛋白起一定作用。