液相色譜儀流動相的選擇與優化

    液相色譜是目前應用多的色譜分析方法，液相色譜系統由流動相儲液體瓶、輸液泵、進樣器、色譜柱、檢測器和記錄器組成，其整體組成類似于氣相色譜，但是針對其流動相為液體的特點作出很多調整。液相色譜的流動相通常是各種低沸點溶劑和水溶液。它是影響分離的一個非常重要因素。在實際工作中，流動相的選擇和優化是確定色譜分析的主要工作。
 

　　選擇方法
 

　　1、由強到弱：一般先用90%的乙腈(或甲醇)/水(或緩沖溶液)進行試驗，這樣可以很快地得到分離結果，然后根據出峰情況調整有機溶劑(乙腈或甲醇)的比例。
 

　　2、三倍規則 ：每減少10%的有機溶劑(甲醇或乙腈)的量，保留因子約增加3倍，此為三倍規則。這是一個聰明而又省力的辦法。調整的過程中，注意觀察各個峰的分離情況。
 

　　3、粗調轉微調：當分離達到一定程度，應將有機溶劑10%的改變量調整為5%，并據此規則逐漸降低調整率，直至各組分的分離情況不再改變。
 

　　脫氣方法
 

　　1、吹氦脫氣法
 

　　利用氦氣在液體中溶解度比空氣低的特性，在0.1MPa壓力下，以約60mL/min流速通入流動相儲液容器中10～15min，可以很有效地從流動相中排除溶解的空氣，能排除接近80%的氧氣。采用一個分布式噴射流裝置，一體積的氦氣可從流動相中將等體積的幾乎全部氣體排除。這意味著1L氦氣通過1L流動相就可完成排氣這個工作。這種脫氣方法雖然好，但氦氣價格較高，很少使用。
 

　　2、加熱回流法
 

　　此法的脫氣效果較好。在操作時要注意冷凝塔的冷卻效率，否則溶劑會丟失，混合流動相的比例會有變化。
 

　　3、抽真空脫氣法
 

　　此法可使用真空泵，降壓至0.05～0.07MPa，即可除去溶解的氣體。但是由于真空脫氣會使混合溶劑組成發生變化，從而影響到實驗的重現性，因此多用于單溶劑體系的簡單分析。
 

　　4、超聲波脫氣法
 

　　將欲脫氣的流動相置于超聲波清洗器中，用超聲波震蕩10～20min。此法的脫氣效果差。
 

　　5、在線脫氣法
 

　　HPLC儀器均可配置專門的在線脫氣機。在線脫氣使用簡單，低故障，有效。
 

　　注意事項
 

　　1、流動相溶劑應選擇HPLC的溶劑或依此為標準的溶劑。流動相使用前用0.45μm濾膜過濾、脫氣，清除微粒和灰塵。 在送液泵內，為了防止雜物(固體)進入流路，裝有吸濾器，但網孔徑為10μm，比此更小的顆粒仍然可通過，這會導致流路和柱子堵塞和污染。為此，建議常用0.45μm濾膜過濾。流動相溶劑須經脫氣，如不脫氣，在溶劑混合時，或壓力溫度變化時容易產生大量氣泡，會導致泵誤動作和輸液不暢，檢測器產生噪聲信號等。
 

　　2、流動相恢復到室溫后使用。流動相溫度與室溫相差時，流動相在恢復到室溫前，基線水平很難穩定，特別是發生漂移，也容易產生氣泡等現象。水與有機溶劑混合時，混合液變化大，往往會與室溫相差很大，務必注意。
 

　　3、做HPLC流動相的試劑應用HPLC級的、水應用二次蒸餾水，水相流動相需經常更換，防止長菌變質。使用去離子水、針劑水、純凈水(炊用)并不合適、尤其是做梯度洗脫時，水中的不純物會成為鬼峰，從而干擾分析結果。
 

　　4、流動相的pH值過高或過低，流動相使用純水，使用高濃度磷酸鹽緩沖溶液，使用離子對試劑等，均可能造成色譜柱填料被化學破壞，這種對色譜柱固定相及鍵合相的破壞通常是不可修復的
 

　　5、用緩沖鹽做流動相時，在使用前和使用后都要用水清洗流路，禁止將緩沖溶液留在流路中靜置過夜或更長時間。
 

　　6、若需要使用含鹽的流動相，使用前請務必過濾。并且使用該含鹽流動相前，色譜柱需先用低比例有機相(有機相含量應不低于10%)的溶液沖洗，以免緩沖鹽析出。流動相若為蒸餾水或含鹽的緩沖液，建議現用現配，以免流動相因滋生微生物而造成柱填料的污染。
 

　　7、進行梯度實驗時要注意梯度變化過程中流動相的互溶性，避免因流動相不互溶而導致的緩沖鹽析出問題。反相系統更換正相系統或正相系統更換反相系統時，用異丙醇置換系統內的儲存流動相后在接柱子。
 

　　8、在更換兩種互不相溶的流動相時，中間要用異丙醇溶液清洗過渡。例如：先用甲醇水做流動相，然后在用正己烷做流動相時，一定要先用異丙醇溶液沖洗甲醇水，然后用正己烷沖洗異丙醇，反之也是一樣。在更換流動相時還要考慮色譜柱是否更換。
 

　　9、儀器在短期(兩三天)不用時，流路中可以是甲醇或水。儀器在長期不用時，流路中應用甲醇。
 

　　10、對于UV等檢測器用于高靈敏度檢測時，要使用UV吸收性小的HPLC的溶劑作為流動相溶劑，如甲醇、乙腈等。
 

　　11、當流動相溶劑為乙腈時，流速為1ml/min泵的正常壓力5～7Mpa之間，如果壓力逐漸降低，基線也出現異常。這是由于乙氰的粘性大，導致泵的流速降低。可適當提高流速使泵的壓力恢復正常即可。
 

　　12、流動相含有濃硫酸、濃硝酸、二氯乙酸、二氯甲烷、氯仿、丙酮、四氯呋南、二甲化砜等溶劑，會對流路中的PEEK樹脂管路強度變成差、PEEK樹脂管容易破裂使溶劑外濺。流動相含有鹵素離子的溶劑，如KCI、NaCI、NH4CI等。對流路中的不銹鋼材料有腐蝕作用，以上的溶劑須盡量避免使用。非用不可時，分析完了后，應立刻用蒸餾水把全流路清洗干凈。
 

　　13、用于檢定梯度等性能時，短時間使用在0.5%以下的低濃度丙酮水溶液是沒有問題的。
 

　　14、注意：稀硝酸與甲醇不能混合，否則有可能會引起爆炸。