牛結核血清抗體用Dot－IGSS檢測步驟

（一）材料與試劑

1．抗原  牛結核PPD。

2．血清  待檢血清、標準結核陽性血清和結核陰性血清。

3．硝酸纖維膜  孔徑0.45μm。

4．氯化金（優質）

5．0.2Mol/L PB液

6．0.05Mol/L Tris—HCl緩沖液

7．硝酸銀顯影液（現用現配）

   明膠（20g/L）                   6.00ml

   對苯二酚（57.90g/L）            3.00ml

   硝酸銀（25g/L）                 0.20ml

   pH3.5檸檬酸鹽緩沖液             1.00ml

   對苯二酚和硝酸銀溶液需避光保存，臨用前將明膠加熱溶解后，按上述比例依次混合。

   pH3.5檸檬酸鹽緩沖液的配制：

   檸檬酸（C₆H₈O₇·H₂O）            25.50g

   檸檬酸三鈉（C₆H₅Na₃·2H₂O）      3.50g

   去離子水                加至    100.00ml

   溶解后即可使用。

8．定影液

   硫代硫酸鈉（Na₂S₂O₃）            20.0g

   去離子水             加至       100.00ml

   溶解即可。

9．兔抗牛IgG抗體。

（二）操作方法

    1．膠體金的制備  試驗用水均要求三蒸餾水并過去離子柱，*終去離子水的電阻大于100萬Ω。所有容器*終均用去離子水清洗。

   （1）采用鞣酸—枸櫞酸鈉還原法制備

   A液  1％HAuCl₄                   2.00ml

        去離子水                    158.00ml

   B液  1％枸櫞酸鈉                 8.00ml

        0.1％Mol/L K₂CO₃            0.20ml

        1％鞣酸                     0.20ml

        去離子水                    31.60ml

   將A液和B液分別于60℃水浴30min，并不時攪拌，迅速將B液加入至A液中，攪拌，顏色為深藍色，繼續加熱至100℃，5 min～10min，溶液顏色變為深紅色，自然冷卻后4℃保存。

   （2）膠體金鑒定：外觀呈深紅色、晶瑩透亮，迎著日光可見有光帶。電鏡觀察膠體金粒子大小平均為10nm，顆粒大小一致，分布均勻。

    2．膠體金與兔抗牛IgG用量比例的確定  每ml膠體金所需的穩定蛋白量是30μg，根據試劑用量增加20％，所以每ml膠體金所需的穩定兔抗牛IgG量為36μg。

    3．金標記兔抗牛IgG的制備  取所需量的兔抗牛IgG，加入少許去離子水，用0.1Mol/L K₂CO₃溶液調pH值為9.0（用精密pH試紙測定），同時膠體金溶液的pH值也調至9.0。在磁力攪拌下，將20ml膠體金溶液加入至兔抗牛IgG中，繼續攪拌10min，加入3.5ml 3％的聚乙二醇（分子量20 000）作為穩定劑，以使其*終濃度達到0.05％，再攪拌15min后，置4℃冰箱保存備用。

    4．金標兔抗牛IgG的純化  將金標記的兔抗牛IgG以2 500r/min離心15min，以除去膠體金的聚合物，取上清以65 000g離心1h，可見離心物分為三層，上層為淡黃色，含有未結合的兔抗牛IgG，下層為近黑色，是尚未結合的膠體金顆粒,*主要的中間層為紅色，是結合良好的金標記的兔抗牛IgG，傾去上層，收集中層液，用含0.1％BSA的0.01Mol/L pH8.2PB混合至原體積的1／10，過濾除菌，分裝，4℃保存備用。

    5．金標記兔抗牛IgG的鑒定

   （1）顆粒大小及均勻度鑒定：取少許金標記的兔抗牛IgG，負染，電鏡觀察顆粒大小及均勻度，并測量粒子直徑大小。

   （2）活性鑒定：將牛IgG點樣于硝酸纖維膜上，直接加金標兔抗牛IgG抗體，應顯示出明顯的粉紅色斑點。

    6．正式試驗程序

   （1）點樣  以打孔器將微孔濾膜制成直徑3mm的膜片。將牛結核PPD用0.01Mol/LpH9.0PBS液稀釋為40μg/ml，用微量加樣器加1μl抗原于膜片中央，37℃烘干10min。

   （2）封閉  將膜片置于0.01Mol/L pH7.4含0.2％BSA的PBST液中，37℃作用45min，其間振蕩數次。取出后以蒸餾水洗滌1次，用濾紙吸干。

   （3）加待檢血清  待檢血清以PBST液做1︰160倍稀釋。將膜片浸入其中，37℃作用1h，其間振蕩數次。取出后，以PBST液洗滌后，濾紙吸干。此步同時設標準陽性血清和陰性血清對照。

   （4）加金標抗體  以PBST液將金標液作1︰10稀釋，將膜片浸入其中，37℃作用2h，中間振蕩數次。

   （5）銀染  將膜片從金標液中取出，于去離子水洗滌3次，每次3min。然后將膜片浸入暗室中的銀染色液中，室溫下作用10min，移入定影液中，室溫作用5min。然后用去離子水沖洗，自然干燥后觀察結果。