試劑: 試樣20μl DNA ladder 瓊脂糖 TAE緩沖液 上樣緩沖液
含0.5μg/ml EB的電泳緩沖液
50×TAE貯存液: Tris 242g
冰乙酸 57.1ml
0.5mol/LEDTA(pH 8.0) 100ml
雙蒸水 至1L
1×TAE 工作液: 40mmol/L Tris-乙酸鹽
1mmol/L EDTA
0.8%瓊脂糖凝膠: 瓊脂糖 0.8g
TAE 100ml
器械 250ml錐形瓶+紙蓋子+棉線繩 50ml量筒 白槍頭 30μl槍 5μl槍
微波爐 電泳儀(梳子,制膠板) 凝膠成像儀
準備
1. 250ml錐形瓶,超生清洗,烘干.
2. 打開電子天平,預熱.
3. 清洗制膠板,梳子,電泳槽.
步驟
1. 按配方配制TAE.
2. 250ml錐形瓶中,按配方加入瓊脂糖和TAE,搖勻. (60ml+0.48g)
用棉線繩扎緊紙蓋子,蓋子上要扎眼透氣.緩沖液體積要小于容器體積的50%.
3. 微波爐,中火加熱,不停觀察,最短時間內,至瓊脂糖完全融化.
4. 待膠稍冷,約60℃,倒入制膠板中.厚度3-5mm.
5. 插入梳子.梳子應在地面上0.5-1mm.
6. rt,30-45min.凝膠完全凝結.
7. 倒入少量電泳緩沖液在凝膠頂部,小心拔出梳子.到處緩沖液.將凝膠放入電泳槽中.
8. 向電泳槽中加入緩沖液,剛好沒過凝膠1mm.
9. 取約5μl上樣緩沖液,與20μl試樣/DNA ladder,分別混合均勻.
10. 將上述混合液,加至加樣孔中. DNA ladder應在最左/右側.
11. 關上電泳槽蓋,接好電源.使DNA從負極(黑)向陽極(紅)移動.
12. 給予60-70V電壓. (1-5V/cm)
13. 待緩沖液前延至膠的2/3時,關閉電源,拔出電極插頭,打開電泳槽蓋.
14. 小心取出凝膠,放入0.5μg/ml的EB液中,浸染30min.
15. 于凝膠成像儀,312nm,觀察,攝像.
注意:
1. 配膠和灌滿電泳槽要使用同一批緩沖液.因為離子強度或pH很小的差別也會在凝膠前部產生紊亂,嚴重影響DNA泳動.