合成全過程可分為三個階段，即原料來源、活化和甘油磷脂生成。甘油磷脂的合成在細胞質滑面內質網上進行，通過高爾基體加工，最后可被組織生物膜利用或成為脂蛋白分泌出細胞。機體各種組織(除成熟紅細胞外)即可以進行磷脂合成。
原料來源
合成甘油磷脂的原料為磷脂酸與取代基團。磷脂酸可由糖和脂轉變生成的甘油和脂肪酸生成(詳見甘油三酯合成代謝)，但其甘油C2位上的脂肪酸多為必需脂肪酸，需食物供給。取代基團中膽堿和乙醇胺可由絲氨酸在體內轉變生成或食物供給。
絲氨酸——→乙醇胺——→膽堿
活化
磷脂酸和取代基團在合成之前，兩者之一必須首先被CTP活化而被CDP攜帶，膽堿與乙醇胺可生成CDP-膽堿和CDP-乙醇胺，磷脂酸可生成CDP-甘油二酯。
甘油磷脂生成
1）磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺
這兩種磷脂生成是由活化的CDP-膽堿與CDP-乙醇胺和甘油二脂生成。此外磷脂酰乙醇胺在肝臟還可由與腺苷蛋氨酸提供甲基轉變為磷脂酰膽堿。不同生物合成磷脂酰膽堿的途徑有所不同。
2）磷脂酰絲氨酸
體內磷脂酰絲氨酸合成是通過Ca2+激活的酰基交換反應生成，由磷脂酰乙醇胺與絲氨酸反應生成磷脂酰絲氨酸和乙醇胺。
磷脂酰乙醇胺 +絲氨酸——→ 磷脂酰絲氨酸 + 乙醇胺
3）磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油和心磷脂
述三者生成是由活化的CDP-甘油二酯與相應取代基團反應生成。
心磷脂的另一條合成途徑。
4）縮醛磷脂與血小板活化因子
縮醛磷脂與血小板活化因子的合成過程與上述磷脂合成過程類似，不同之處在于磷脂酸合成之前，由糖代謝中間產物磷酸二羥丙酮轉變生成脂酰磷酸二羥丙酮以后，由一分子長鏈脂肪醇取代其第一位脂酰基，其后再經還原(由NADPH供H)、轉酰基等步驟合成磷脂酸的衍生物。此產物替代磷脂酸為起始物，沿甘油三酯途徑合成膽堿或乙醇胺縮醛磷脂。血小板活化因子與縮醛磷脂的不同在于長鏈脂肪醇是飽和長鏈醇，第2位的脂酰基為最簡單的乙酰基。