用蛋白酶K和SDS從大規模培養物中提取λ噬菌體

蛋白酶 K 限制性內切核酸酶 λ 噬菌體顆粒

氯仿 透析緩沖液 EDTA 乙醇 酚 酚：氯仿 SDS 乙酸鈉 TE

瓊脂糖凝膠 Sorvall SS-34 轉子或相當型號 硼硅酸鹽巴斯德吸管 水浴

一、材料

1. 緩沖液和溶液

(1) 氯仿

(2) 透析緩沖液

10 mmol/L NaCl

50 mmol/L Tris-Cl（pH 8.0)

10 mmol/L MgCl₂

需要兩份透析緩沖液，每份為噬菌體溶液體積的 1000 倍，室溫保存。

(3) EDTA ( 0.5 mol/L，pH 8.0)

(4) 乙醇

(5) 酚

(6) 酚：氯仿（1:1，V/V）

(7) SDS (10%，m/V)

(8) 乙酸鈉（3 mol/L，pH 7.0)

(9) TE ( pH 7.6 和 pH 8.0)

2. 酶和緩沖液

蛋白酶 K

限制性內切核酸酶

3. 凝膠

瓊脂糖凝膠（0.7%)，用 0.5X TBE，含 0.5 μg/ml 溴化乙錠

4. 離心機和轉子

Sorvall SS-34 轉子或相當型號

5. 專用設備

硼硅酸鹽巴斯德吸管（密封）或 Shepherd 鉤

透析袋，煮過

預置 56℃ 的水浴

6. 載體和菌株

于 CsCl 懸浮液中的 λ 噬菌體顆粒

二、方法

噬菌體懸浮液的透析

1. 將制備好的噬菌體懸浮液裝入一端打結或用塑料夾進行封閉的透析袋內，然后封住透析袋的另一端，放入含超過 1000 倍的透析緩沖液和一磁力攪拌器的燒杯中，于室溫慢慢攪拌中透析 1 h。

2. 將透析袋轉移至另一裝有新鮮緩沖液的燒杯中，再透析 1 h。

3. 將噬菌體懸浮液轉入聚丙烯離心管中。

不要超過管體積的 1/3。

4. 在透析過的噬菌體懸浮液中加入 0.5 mol/L EDTA ( pH 8.0) 至終濃度為 20 mmol/L。

噬菌體顆粒的抽提

5. 在懸浮液中加入蛋白酶 K 至終濃度為 50 μg/ml。

6. 加 SDS 至終濃度為 0.5%，通過將離心管輕輕地上下顛倒數次進行混勻。

溶液的外觀將快速改變，從略顯藍色的噬菌體顆粒懸浮液轉變成含病毒 DNA 和病毒外殼蛋白裂解物的清亮溶液。

7. 將消化混合物于 56℃ 溫育 1 h，然后冷卻至室溫。

8. 加入等體積的平衡酚，通過將離心管輕輕上下顛倒數次，混勻有機相和水相，直至形成一完全的乳狀液。

9. 3000 g（5000 r/min 于 Sorvall SS-34 轉子中）室溫離心 5 min 將兩相分離，用寬口吸管將親水相轉移至一干凈離心管中。

10. 用 1:1 的平衡酚和氯仿混合物抽提親水相。

11. 如上所述（步驟 9 ) 回收親水相，用等體積的氯仿重新抽提一次。大規模制備，轉入步驟 12。

小量制備（從 50~100 ml 培養物中制備的噬菌體）

(1) 用標準乙醇沉淀回收噬菌體 DNA。

(2) 將溶液于室溫放置 30 min。

當加入乙醇后，λ 噬菌體 DNA 將出現絲狀沉淀，可用口封住的硼硅酸鹽巴斯德吸管或 Shepherd 鉤從溶液中撈出。

(3) 將 DNA 重新溶解于適當體積的 TE ( pH 7.6) 中，轉入步騾 14。

CsCl 的去除

12. 將親水相轉移至透析袋中。

13. 將噬菌體 DNA 樣品于 1000 倍的 TE ( pH 8.0) 中 4℃ 透析過夜，其間 TE 溶液更換三次。

14. 測定溶液 260 nm 處的吸光值，計算 DNA 的濃度。

1OD₂₆₀=50 μg/ml 雙鏈 DNA。單個噬菌體顆粒大約含有 5X10-11 μg DNA。噬菌體 DNA 的得率依賴于裂解培養物中噬菌體的滴度，通常為每升 500 μg 至數毫克。

15. 采用適當大小的分子質量標準，經 0.7% 瓊脂糖電泳分析未消化的或已用適當限制酶切割的部分 DNA ( 0.5 μg)，檢査噬菌體 DNA 的完整性。

16. 將噬菌體 DNA 于 4℃ 保存。