用非同位素探針進行原位雜交和檢測實驗——熒光原位雜交

載有樣本的載玻片

20?150 ng非同位素標記的DNA探針去離子的甲酰胺l0 mg mL經超聲處理的鮭精DNA主雜交混合液50% (V V)甲酰胺（未去離子）SSCpH 7.0生物素檢測液或地高辛檢測液或生物素 地高辛檢測液0.1% (V V) Triton ×-100 4×SSCDAPI或碘化丙錠染色溶液防褪色固片介質

水浴鍋相差顯微鏡蓋玻片橡皮泥加濕盒有干燥劑的玻片盒指甲油具落射光源及濾光片裝置的熒光顯微鏡。此鏡應與所用熒光染料相配帶有雙光區 (熒光素 得克薩斯紅）或三光區（熒光素 得克薩斯紅 DAPI)的濾光片 Ektar-IOOO 或 Ektachrome-400 彩色感光片或 Technical Pan 2415 黑白感光片

1a)石蠟切片或細胞的雜交，對載玻片進行脫蠟、水化、 封閉和脫水處理。將標本晾干（或在干燥器中干燥），隨后儲于加有干燥劑的載玻片盒中，置-70℃過夜。至關重要的是標本在儲放前應絕對干燥。

1b)冰凍切片的雜交：進行切片的預處理和乙酰化處 理，隨后進行切片的脫水。標本絕對干燥至關重要，此時切片即可用于雜交（步驟3)。雜交應馬上進行。

2) 對每一雜交實驗，可用乙醇沉淀10?15 ng探針，重溶于10μL去離子的甲酰胺中， 加5μg (0. 5μL)超聲處理的鮭精DNA,在70°C?80°C溫度下熱變性探針10 min。

3) 加10μL主雜交混合液于變性探針中（探針終濃度為0.1?0.5μg/mL)。混勻，微量 離心機以高速稍加離心，然后加于載玻片上。覆加22 mm²蓋玻片，輕壓以趕去大的氣泡。放入加濕盒中，在37℃溫育2?4h。

雜交也可過夜，若雜交過夜，則用橡皮泥封住蓋玻片。

4) 雜交最后30 min期間，以37℃水浴，在Coplin廣口瓶中，預熱50 mL 50%甲酰胺/ 2×SSC 洗液和 50 mL 2×SSC。

5) 從加濕盒中取出載玻片，剝去橡皮泥（如有使用的話）并小心移去蓋玻片。在37℃ 50%甲酰胺/2 × SSC中，清洗雜交過的玻片15 min；接著以37℃ 2 × SSC洗15 min；再于室溫以1×SSC洗15 min。

6) 玻片在室溫下，以4×SSC平衡5 min。取出載玻片吸去殘余緩沖液，在此過程中任何時候都不要使玻片干涸。

7) 加50μL生物素檢測液、地高辛檢測液或生物素/地高辛檢測液于雜交過的載玻片上。用22 mm²大小的Parafilm覆蓋，放在一用鋁箔包裹的加濕盒中，于37℃溫育 45 min。

8) 室溫下，按順序在裹以鋁箔的Coplin廣口瓶中，分別用4×SSC、0.1% Triton ×- 100/4×SSC和4×SSC浸洗切片。每種溶液中浸洗10 min。

9) 加50μLDAPI或碘化丙錠染色液于切片上，以一塊22 mm2的Parafilm膜覆蓋。室溫下染色5 min。在盛有1×SSC的Coplin廣口瓶中短暫浸洗，以除去多余染液。吸去殘液但不要使切片干涸。

10) 加7μL適當的防褪色固片介質于已染色的切片上，覆以蓋玻片。輕輕擠壓除去多余的防褪色固片介質，注意勿損傷組織切片。以指甲油密封蓋玻片，放在有干燥劑的玻片盒中，儲于-20℃。

11) 用具落射光源以及有適合實驗中所用熒光染料濾光片的熒光顯微鏡，觀察實驗結果。

12) 用Ektar-1000(用于打印）或EktachronnHtOO (用于載玻片）彩色感光片照相。 曝光時間依雜交信號亮度而定，但對DAPI的曝光時間為2 s，經雙光區或三光區濾光片設施的 曝光時間分別為30?90 s和3?8 S。對亮的雜交信號可用黑白感光片，如用Kodak Technical Pan 2415 ASA 200感光片進行曝光。

注意：實驗用水須以DEPC處理，所用溶液的配制均使用DEPC處理過的水，以抑制RNA酶活性。