磁微粒化學發光酶免疫分析法檢測血清fPSA方法學建立

　　前列腺特異性抗原(Prostate Specific Antigen, PSA)是人體前列腺上皮組織細胞分泌的一種分子量為30～33 kDa的單鏈糖蛋白分子[1～3]。前列腺癌(Prostate Cancer, PCa)病人血清中PSA濃度升高;良性前列腺增生(Benign Prostate Hyperplasia, BPH)病人血清中,PSA濃度也會升高;隨著年齡的增加,血清中PSA濃度也有不同程度的升高,在4～10 ng/ml的濃度范圍就形成了診斷灰區[4~6]。PCa病人血清中f-PSA濃度水平與BPH病人以及正常人相比,明顯偏低,游離前列腺特異抗原百分率對PCa的特異性更高,可降低臨床檢驗篩查的假陽性率。建立特異性強、檢測靈敏度高的新型f-PSA檢測試劑將會對前列腺相關疾病的檢測具有較高的臨床應用價值。 
　　1.材料及方法 
　　1.1試劑: PSA、fPSA單克隆抗體購自美國Seradyn公司;辣根過氧化物酶、魯米諾購自sigma公司;f-PSA化學發光免疫分析(CLIA)試劑盒購自Roche公司。 
　　1.2儀器:LUMO微孔板化學發光檢測儀、IWO型洗板機(鄭州安圖生物工程有限公司);羅氏ELESYS2010電化學發光儀。 
　　1.3臨床樣本:臨床樣本由腫瘤醫院提供。 
　　2.實驗方法 
　　2.1 方法學原理:選用一步反應雙抗體夾心法檢測f-PSA抗原。磁微粒表面結合PSA單克隆抗體;加入待檢測校準品、臨床血清和酶標記抗體;溫浴反應后形成固相抗體-抗原-酶結合抗體的復合物,通過洗滌分離游離的抗原和酶標記抗體,加入發光底物,使用化學發光檢測儀檢測信號強度,結合標準曲線來實現對待測樣品的定量分析。 
　　2.2 抗體包被磁微粒:將300mg磁微粒分散于2ml包被液(0.05Mol/L pH 9.5碳酸鹽緩沖液)中,室溫下振蕩4h,用20ml封閉液(0.5%BSA,pH 7.5磷酸鹽緩沖液)封閉4h,最終使用封閉保存液調整磁微粒濃度30mg/ml,密封置于冰箱2～8℃保存備用。 
　　2.2HRP抗體酶結合物的制備:采用改良過碘酸鈉法完成HRP對f-PSA單克隆抗體的標記,酶結合物保持單克隆抗體的免疫反應活性和酶的催化活性。 
　　2.3f-PSA校準品的配制:校準品經由國家標準標定,分裝,冷凍保存。 
　　2.4血清f-PSA的化學發光酶免疫分析方法:向微孔板中每孔加入校準品或樣品50μL,磁微粒50μL,酶結合物溶液100μL,37℃溫育30min,使用磁分離洗滌設備洗滌4次,加入發光底物100μL,室溫避光反應5 min,測量相對發光強度單位(RLU),通過標準曲線對血清中f-PSA實現定量分析。 
　　3.結果分析 
　　3.1 包被濃度的影響:比較不同的包被濃度(1.0、2.0、3.0和5.0 ug/ml)對體系的影響。隨著包被濃度的提高,校準品信號值升高,濃度達到3ug/ml后,校準品對應發光值開始下降,認為3ug/ml的包被濃度已經達到飽和。 
　　 3.2酶結合物濃溶優選:將酶結合物分別以1∶1000、1∶2000、1∶3000進行稀釋,比較不同分析結果的影響。結果表明,在1∶2000稀釋比條件下,校準品信號值、靈敏度、線性、HOOK值檢出均達到最佳。 
　　3.3溫育時間:考察了不同溫育時間對反應體系的影響,溫育時間超過30min后,校準品信號值不再升高,表明免疫反應達到飽和,最終確定溫浴時間為30min。 
　　3.4溫浴條件:考察了三種不同的溫育方式,即4度、室溫和37℃對反應體系的影響。37度時RLU較室溫反應提高57%,同時考慮37℃恒溫溫育的條件更容易控制,選擇37℃恒溫溫育作為溫育條件。 
　　3.5 性能評價 
　　根據國家相關化學發光檢測試劑質量標準,對建立的磁微粒化學發光f-PSA進行評價,結果如下: 
　　臨床考核研究選用本院電化學發光檢測試劑為對照組。自2009年7月以來,收集經病理中心確診前列腺患者血清樣本43份、前列腺炎患者血清樣本142份,隨機收集正常男性血清樣本325份。血清按照檢測試劑盒要求采集的非抗凝血清,樣本需清亮不混濁、樣本量不少于300μl。采集后2~8 oC冷藏,如1天內不檢測,則應冷凍(-20oC)保存,不得反復凍融。其測定值相關性及相關系數分別為:Y(磁發光) = 1.0075x (Roche)+ 0.0386R= 0.9953 

　　4 討論 
　　本方法為化學發光酶聯免疫系統與磁性微粒分離技術相結合的一種測定方法,它使雙抗體夾心酶聯免疫技術在游離標記抗體和抗原復合物中具有分離完全和快速的優點。建立的f-PSA檢測方法重復性良好,線性范圍寬,具有較高的精密性和準確度,特異性強。經過對510份臨床血清研究表明與電化學發光檢測結果符合程度達到0.99以上。 
　　此方法操作簡便、快捷,全部測定時間僅需40分鐘,顯著提高工作效率,滿足醫生及病人即刻出結果的要求。