離子交換層析(IonExchangeChromatography,IEC)(3)

其次是對離子交換劑基質的選擇。前面已經介紹了，聚苯乙烯離子交換劑等疏水性較強的離子交換劑一般常用于分離小分子物質，如無機離子、氨基酸、核苷酸等。而纖維素、葡聚糖、瓊脂糖等離子交換劑親水性較強，適合于分離蛋白質等大分子物質。一般纖維素離子交換劑價格較低，但分辨率和穩定性都較低，適于初步分離和大量制備。葡聚糖離子交換劑的分辨率和價格適中，但受外界影響
較大，體積可能隨離子強度和pH 變化有較大改變，影響分辨率。瓊脂糖離子交換劑機械穩定性較好，
分辨率也較高，但價格較貴。
另外離子交換劑顆粒大小也會影響分離的效果。離子交換劑顆粒一般呈球形，顆粒的大小通常以目數(mesh)或者顆粒直徑(mm)來表示，目數越大表示直徑越小。前面在介紹交換容量時提到了一些關于交換劑顆粒大小、孔隙的選擇。另外離子交換層析柱的分辨率和流速也都與所用的離子交換劑顆粒大小有關。一般來說顆粒小，分辨率高，但平衡離子的平衡時間長，流速慢；顆粒大則相反。所以大顆粒的離子交換劑適合于對分辨率要求不高的大規模制備性分離，而小顆粒的離子交換劑適于需要高分辨率的分析或分離。
這里特別要提到的是，離子交換纖維素目前種類很多，其中以DEAE-纖維素(二乙基氨基纖維素)和CM-纖維素(羧甲基纖維素)最常用，它們在生物大分子物質(蛋白質，酶，核酸等)的分離方面顯示很大的優越性。一是它具有開放性長鏈和松散的網狀結構，有較大的表面積，大分子可自由通過，使它的實際交換容量要比離子交換樹脂大的多；二是它具有親水性，對蛋白質等生物大分子物質吸附的不太牢，用較溫和的洗脫條件就可達到分離的目的，因此不致引起生物大分子物質的變性和失活。三是它的回收率高。所以離子交換纖維素已成為非常重要的一類離子交換劑。
(2)離子交換劑的處理和保存
離子交換劑使用前一般要進行處理。干粉狀的離子交換劑首先要進行膨化，將干粉在水中充分溶脹，以使離子交換劑顆粒的孔隙增大，具有交換活性的電荷基團充分暴露出來。而后用水懸浮去除雜質和細小顆粒。再用酸堿分別浸泡，每一種試劑處理后要用水洗至中性，再用另一種試劑處理，最后再用水洗至中性，這是為了進一步去除雜質，并使離子交換劑帶上需要的平衡離子。市售的離子交換劑中通常陽離子交換劑為Na 型(即平衡離子是Na 離子)，陰離子交換劑為Cl 型，因為通常這樣比較穩定。處理時一般陽離子交換劑最后用堿處理，陰離子交換劑最后用酸處理。常用的酸是HCl，堿是NaOH 或再加一定的NaCl，這樣處理后陽離子交換劑為Na 型，陰離子交換劑為Cl 型。使用的酸堿濃度一般小于0.5mol/L，浸泡時間一般30min。處理時應注意酸堿濃度不宜過高、處理時間不宜過長、溫度不宜過高，以免離子交換劑被破壞。另外要注意的是離子交換劑使用前要排除氣泡，否則會影響分離效果。
離子交換劑的再生是指對使用過的離子交換劑進行處理，使其恢復原來性狀的過程。前面介紹的酸堿交替浸泡的處理方法就可以使離子交換劑再生。離子交換劑的轉型是指離子交換劑由一種平衡離子轉為另一種平衡離子的過程。如對陰離子交換劑用HCl 處理可將其轉為Cl 型，用NaOH 處理可轉為OH 型，用甲酸鈉處理可轉為甲酸型等等。對離子交換劑的處理、再生和轉型的目的是一致的，都
是為了使離子交換劑帶上所需的平衡離子。
前面已經介紹了，離子交換層析就是通過離子交換劑上的平衡離子與樣品中的組分離子進行可逆的交換而實現分離的目的，因此在離子交換層析前要注意使離子交換劑帶上合適的平衡離子，使平衡離子能與樣品中的組分離子進行有效的交換。如果平衡離子與離子交換劑結合力過強，會造成組分離子難以與交換劑結合而使交換容量降低。另外還要保證平衡離子不對樣品組分有明顯影響。因為在分離過程中，平衡離子被置換到流動相中，它不能對樣品組分有污染或破壞。如在制備過程中用到的離子交換劑的平衡離子是H 或OH 離子，因為其它離子都會對純水有污染。但是在分離蛋白質時，一般不能使用H 或OH 型離子交換劑，因為分離過程中H 或OH 離子被置換出來都會改變層析柱內pH 值，影響分離效果，甚至引起蛋白質的變性。離子交換劑保存時應首先處理洗凈蛋白等雜質，并加入適當的防腐劑，一般加入0.02 %的疊氮鈉，4°C 下保存。
離子交換層析的基本操作
離子交換層析的基本裝置及操作步驟與前面介紹的柱層析類似，這里就不再重復了。下面主要介紹離子交換層析操作中應注意的一些具體問題。
(1)層析柱
離子交換層析要根據分離的樣品量選擇合適的層析柱，離子交換用的層析柱一般粗而短，不宜過長。直徑和柱長比一般為1:10到1:50之間，層析柱安裝要垂直。裝柱時要均勻平整，不能有氣泡。