核酸提取分離方法
核酸提取分為傳統方法和商業化試劑抽提。
傳統的方法一般會采用酚/氯仿抽提及乙醇沉淀來提取核酸。
商業化試劑盒方法提取核酸,比較經典的是采用離心柱法,將硅膠膜固定在離心管中,通過離心力或者負壓讓液體通過硅膠膜,核酸就留在膜上。在經過洗滌、洗脫的步驟得到核酸。商業化試劑盒的應用還能避免試劑污染。
不管是傳統的方法,還是商業化試劑盒方法,都需要注意下面這些問題。
溫度
核酸是非常敏感脆弱的樣品,所以離心機的控溫性能要好,才能防止核酸降解。
離心的溫度盡量維持在 4 ℃,轉子的材料也要盡量選用導熱性能好的材料,防止樣品溫度和設置的溫度偏差變大。
角度與離心力
轉子的設計角度, 45° 角轉是比較優秀的,便于核酸的收集,還能減少樣品的損失。離心力設置盡量大于 10,000 x g, 離心力越大,離心時間越短。
其他注意點
● 提取核酸的試劑會有一定的腐蝕性,為了防止試劑腐蝕轉子,最好選擇帶 PTFE 涂層的轉子,這種涂層耐酸、耐堿、耐各種有機溶劑。
● 在使用試劑盒抽提的時候,要盡量選用試劑盒專用的 Kit 轉子,不需要剪蓋,轉子邊緣采用加寬設計防止打掉離心管蓋。
血液(采血管)的離心分離
收集血液之后,一般是對真空采血管進行離心,真空采血管管內為負壓并且密封良好。
根據診斷目的的不同,有的時候血液樣本也需要進行離心分離處理。
這個時候,也需要用到離心機啦。
溫度
對血液樣本后續處理方式不同,對溫度的要求也不同。
角度與離心力
因為醫院需要處理的樣本比較多,大通量的離心處理是更有優勢的。
一般選用水平轉子進行離心分離,通量大,分離效果好,用角轉也可以進行分離,不過優勢沒有水平轉子明顯。分離所需要的離心力較小,一般小于2,500 x g。比如在《臨床化學檢驗血液標本的收集與處理》要求中,就提到了將相對離心力控制在1,000 x g~1,200 x g。
氣密性與防污染
為了安全起見,選用氣密性的吊籃,防止采血管破裂產生的氣溶膠污染。定期對離心機的吊籃和適配器進行高壓滅菌,也能進一步預防污染的發生。
其他注意點
帶軟加速/剎車功能的離心機,能防止離心分層后的樣品重懸。
PBMC 單核細胞的密度梯度離心分離
血液主要由血清和血細胞組成,主要包括紅細胞,白細胞和血小板等。白細胞還可以細分為淋巴細胞和單核細胞等。由于這些細胞具有簡單的細胞核,統稱為外周血單核細胞 (PBMC)。
PBMC 單核細胞可通過 Ficoll 密度梯度離心的方法,從血液中進行分離。
在 Ficoll 密度梯度離心的過程中,需要注意的有:
● 使 Ficoll-Paque Plus 和 PBS 升至室溫,并用 70% 乙醇消毒血袋外部,良好的溫度 (18-20℃) 控制有利于穩定 Ficoll 的密度,可以實現更好的分離效果
● 血液與 PBS 的比例保持 1:1,擰緊蓋后顛倒混合幾次
● 可以使用 ep 25 mL 錐底管,并輕輕的將血液/PBS 混合物鋪置 Ficoll 上
● 離心參數:400 x g, 20 ℃,加減檔 0/0,防止離心結束后的剎車震動,降低重懸,更利于良好分層。隨后開啟“Atset”功能,可以在達到指定轉速后開始計時,離心 30 分鐘
● 使用 PBS 洗滌細胞,離心除去殘余的 Ficoll 液,400 x g, 20 ℃,10 分鐘,重復幾次
細胞培養液的離心分離
在收集我們精心培育的細胞的時候,一般會選擇錐底形狀的離心管或者離心瓶,并且采用低速的水平轉子來進行離心。
為了保持細胞的完整性,離心的時候要盡量避免使用急剎車。選擇帶軟剎車/加速(多檔剎車/加速)的離心機,可以避免收集到的細胞重懸。