在科研的戰場上，你是否還在苦于尋找更出色的成像技術與手段？你是否還在糾結觀察到的實驗現象能否真實的反映樣品的情況？你是否還在為圖像質量差而不能發表高質量的論文而苦惱？“工欲善其事必先利其器”，共聚焦將為你更好的解決這些問題。
與傳統的寬場成像相比，共聚焦作為一種高端的顯微成像術，以其出色的成像質量及三維重構能力，儼然已成為一種主流的成像方式。接下來小編將帶你進入共聚焦的世界，為你淺析共聚焦的基本原理及其在生物研究領域的應用。
共聚焦原理
激光共聚焦顯微鏡（Confocal laser scanning microscope，CLSM）利用放置在光源（激光）后的照明針孔和放置在檢測器前的探測針孔（pinhole）實現點照明和點探測，光源通過照明針孔發射出的光聚焦在樣品焦平面的某個點上，該點所發射的熒光成像在探測針孔內，焦平面以外的任何發射光均被探測針孔阻擋。因此，通過共聚焦能夠清晰地獲得焦平面上的熒光信號。
圖1 左右兩邊分別是普通寬場顯微鏡和共聚焦顯微鏡的成像光路，共聚焦顯微鏡利用點探測和點照明技術獲得高清晰度的圖像。
計算機以像點的方式將被探測點顯示在計算機屏幕上，由光路中的掃描系統在樣品焦平面上掃描，從而產生一幅完整的共焦圖像。隨著載物臺沿Z軸上下移動，樣品的新層面又成像在顯示器上，這樣就可得到樣品不同層面的連續光切圖像(Z-stack)，進一步通過三維重構就能獲得樣品精確的三維信息。
圖2 左：共聚焦顯微鏡的點掃描及Z軸層切模式；右：通過共聚焦顯微術對視網膜神經元進行三維重構。
共聚焦應用
相對于普通寬場成像，共聚焦能獲得高分辨率高清晰度的三維圖像，因此其應用范圍更廣，接下來小編將介紹共聚焦顯微鏡在生物研究領域的幾點重要應用。
熒光定位及三維重建
激光共聚焦顯微鏡最重要的應用莫過于熒光定位的觀察與三維重構。通過熒光定位觀察可以得知感興趣的蛋白在細胞或組織中的定位情況，而結合對細胞器或細胞骨架等結構進行標記可以得到該蛋白的亞細胞定位，通過與其他蛋白進行雙色或多色共染可以分析兩個或多個蛋白的共定位情況。
圖3 左: 通過共聚焦顯微鏡對細胞微絲骨架（綠色，phalloidin）及線粒體（紅色，mitrotracker）結構的清晰成像；右：通過共聚焦顯微鏡對果蠅卵結構的三維重構。
共聚焦通過點掃描對樣品進行成像，通過不斷移動Z軸實現對樣品的三維層切并通過三維重構獲得樣品精確的三維信息（被稱為“細胞 CT”），進而可以更準確地在Z軸上分析蛋白的定位情況。
熒光定量及共定位分析
如果你要對樣品的熒光信號進行定量，那么通過徠卡共聚焦顯微鏡操作軟件可以輕松達到這一目的，操作簡便快捷。
圖4 通過共聚焦軟件對熒光信號進行定量：選中quantify-intensity-stack profile選項，通過ROI工具框選待分析區域，在窗口中間即顯示所選區域的所有信息，包括熒光通道、平均熒光
如果你要對兩個或多個信號進行共定位分析，我們的軟件也應對自如。