點樣是將經處理后的樣品點加在薄層的特定部位，這是一項需要十分仔細的操作步驟，點樣的好壞會直接影響分離效果。點樣可用玻璃毛細管，如作定量測定，應使用微量移液管或微量注射器，市售血球計數管經加工磨尖頭部并標定體積后使用也甚理想。點樣的位置，上行展開法一般點樣在離薄層下端4～5cm處，下行展開法在離上端6～8cm處。如作雙相紙層析分離，點樣處應位于距薄層右側邊5cm與距底邊5cm直線的交點。
薄層層析點樣方法應注意以下幾點：
(1)樣品最好用具揮發性的有機溶劑(如乙醇、氯仿等)溶解，不應用水溶液，因水分子與吸附劑的相互作用力較弱，當它占據了吸附劑表面上的活性位置時，就使吸附劑的活性降低，而使斑點擴散。
(2)點樣量不宜太多，否則會降低Rf值，一般為幾到幾十μg，體積為1～20μg。
(3)原點直徑要控制在2mm以內。欲達此目的，就須分次點樣，邊點樣，邊用冷、熱風交替吹干。
(4)薄層板在空氣中不能放置太久，否則會因吸潮降低活性。