當肝或腎以丙酮酸為原料進行糖異生時，糖異生中的其中七步反應是糖酵解中的逆反應，它們有相同的酶催化。但是糖酵解中有三步反應，是不可逆反應。在糖異生時必須繞過這三步反應，代價是更多的能量消耗。
這三步反應都是強放熱反應，它們分別是：
1、葡萄糖經己糖激酶催化生成6磷酸葡萄糖 ΔG= -33.5 kJ/mol；
2、6磷酸果糖經磷酸果糖激酶催化生成1，6二磷酸果糖ΔG= -22.2 kJ/mol；
3、磷酸烯醇式丙酮酸經丙酮酸激酶生成丙酮酸 ΔG= -16.7 kJ/mol。
這三步反應會這樣被繞過：
1、葡萄糖-6-磷酸酶催化6-磷酸葡萄糖生成葡萄糖；
2、果糖1，6-二磷酸酶催化1，6-二磷酸果糖生成6-磷酸果糖；
3、此過程由兩個反應組成，第一個反應由丙酮酸羧化酶催化，輔酶是生物素，反應消耗1分子ATP。第二個反應由磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶催化，反應消耗1分子GTP。
由于丙酮酸羧化酶僅存在于線粒體內，故胞液中的丙酮酸必須進入線粒體，才能羧化生成草酰乙酸。而磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶在線粒體和胞液中都存在，因此草酰乙酸可在線粒體中直接轉變為磷酸烯醇式丙酮酸再進入胞液，也可在胞液中被轉變成磷酸烯醇式丙酮酸。但是，草酰乙酸不能直接透過線粒體，需借助兩種方式將其轉運入胞液：一種是經蘋果酸脫氫酶作用，將其還原成蘋果酸，然后再通過線粒體膜進入胞液，再由胞液中蘋果酸脫氫酶將蘋果酸脫氫氧化為草酰乙酸而進入糖異生反應途徑。另一種方式是經谷草轉氨酶作用，生成天冬氨酸后再逸出線粒體，進入胞液的天冬氨酸再經胞液中谷草轉氨酶的催化而恢復生成草酰乙酸。有實驗表明，以丙酮酸或能轉變成丙酮酸的某些生糖氨基酸作為原料異生成糖時，以蘋果酸通過線粒體方式進行糖異生；而乳酸進行糖異生反應時，常在線粒體生成草酰乙酸后，再轉變成天冬氨酸而進入胞液。