聚合酶鏈式反應

一、材料

1. 緩沖液與溶液

10X 擴增緩沖液

氯仿

4 種 dNTP 貯存液（20 mmol/L，pH 8.0)

2. 酶與緩沖液

熱穩定 DNA 聚合酶

3. 凝膠

聚丙烯酰胺凝膠或瓊脂糖凝膠

4. 核苷酸與寡聚核苷酸

旁觀者 DNA

正向引物（20 μmol/L）及反向引物（20 μmol/L) 溶于水中


模板 DNA

5. 特殊設備

自動微量移液器的屏蔽型槍頭

離心管（0.5 ml，薄壁擴增反應專用離心管）

正向排液式移液器

6. PCR 儀

二、方法

1. 按以下次序，將各成分加在 0.5 ml 滅菌離心管、擴增管或滅菌滴定板的孔內混合：

10X 擴增緩沖液                                      5 μl

20 mmol/L 4 種 dNTP 混合液（pH 8.0）  1 μl

20 μmol/L 正向引物                                2.5 μl

20 μmol/L 反向引物                                2.5 μl

1~5 U/μl 熱穩定 DNA 聚合酶                  1~2 單位

H₂O                                                     28~33 μl

模板 DNA                                              5~10 μl

總體積                                                  50 μl




2. 如果 PCR 儀沒有配置加熱蓋，在反應混合液的上層應加一滴輕礦物油（約 50 μl)， 防止樣品在 PCR 反應多個循環過程中蒸發。如果應用熱啟動方案程序，在反應混合液的上層可加一層石蠟油。放置微量離心管或微量滴定板在 PCR 儀上。

3. 按以下方法進行 PCR 擴增。典型的程序有變性、復性和聚合（延伸反應）；相應的循環條件與溫度列表如下：



這些循環數設置適合 50 μl 反應體系在 0.5 ml 薄壁離心管內進行，反應管溫育在 PCR 儀上進行靶基因擴增，所用 PCR 儀可以是 Perkin-Elmer9600 或 9700；也可以是 Eppendorf 公司的 Master cycler PCR 儀；也可以是 MJ Research 公司的 PTC100。這里的循環數與溫度設置條件也可能適合在其他類型的設備及不同的反應體積。

聚合反應應該根據靶基因的長度按每分鐘聚合 1000 bp 的速率來計算所要設置進行聚合反應的時間。大多數 PCR 儀設置的最后一個程序是擴增樣品溫育在 4℃ 上，直到擴增樣品從 PCR 儀上取走。有些擴增樣品可以在 PCR 儀上過夜，以后貯存在 -20℃ 中。

4. 抽取每種擴增樣品 5~10 μl 用瓊脂凝膠電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳來分析擴增結果，用 DNA marker 來判斷擴增片段的大小。凝膠一般用 EB ( 溴化乙錠）或 SYBR 金顆粒染色后來觀察擴增的量與片段大小。

一次成功的擴增反應應該產生與我們預期大小一致的 DNA 片段。擴增條帶可用 DNA 序列分析，Southern 雜交和限制性內切核酸釀酶切圖譜予以鑒定。

如果以上這些鑒定都表明擴增產物是正確的，則從凝膠電泳的不同泳道可做進 一步分析；從兩管陽性對照樣品的相應分子量的目的條帶的亮度與粗細可判斷 PCR 擴增的效率；陰性對照樣品在目的條帶附近應該沒有相應條帶的。

5. 若用礦物油覆在微量離心管內樣品液體的上層，反應結束后可用 150 μl 氯仿抽提去除。

在 PCR 反應管內，包含擴增 DNA 片段的水相與上層礦物油的界面形成彎月面，在彎月面下面的水相還有微膠粒。可用自動移液器小心吸取水相液體轉移到一個新的離心管內。為了許多目的（如用 Cemricon 微量濃縮器純化擴增 DNA 樣品或者進一步克隆這種擴增產物）都必須把這種礦物油從樣品中去除。

PCR 的優化

在 PCR 的優化開始階段，應用新的 DNA 模板，引物或熱穩定 DNA 聚合酶等材料建立的 PCR 方法，其擴增效果一般總不是最佳的。這種 PCR 反應通常要求盡量抑制非特異性擴增和（或）增加目的 DNA 產物的產率。