操作方法是病人彎曲側臥床上，雙手抱膝，使腰椎后凸、椎間隙增寬。局部常規消毒，浸潤麻醉后，穿刺。一般刺入4～5cm即有阻力，感覺阻力突然降低，以后拔出針芯，轉動針尾即可見腦脊液滴出。按著不同目的與具體情況放取腦脊液。然后插上針芯，拔出穿刺針，用消毒紗布塊固定，去枕平臥4～6小時。
腰椎穿刺前應注意如局部皮膚、軟組織、骨有炎癥時不可穿刺；顱內明顯壓力增高有腦疝跡象者不能穿刺；病情危重處于休克或瀕于休克者不能穿刺；有脊髓壓迫癥狀病、脊髓功能已處于完全消失的臨界狀態不可穿刺。穿刺術后預防頭痛、腦疝形成和感染的發生。