自動凈化、檢測毒素的方案探討

發布時間：2020-03-10 22:59 原文鏈接：自動凈化、檢測毒素的方案探討

鑒于生物毒素的高毒性和高致癌性，在分析過程中希望盡量避免操作人員的暴露時間。同時，為了提高分析效率，降低分析費用，提高分析的重現性，實現生物毒素分析的自動化是十分必要的。

生物毒素的分析通常包括提取、凈化、分析三個步驟。提取步驟一般采用溶劑震蕩提或者索氏提取的方法，此類方法較難自動化實現。最近亦有人采用壓力溶劑萃取(ASE)對黃曲霉毒素進行提取研究。將硅藻土與磨碎的樣品混合在一起，以甲醇: 乙腈(1:1)為萃取溶劑，在80℃的條件下萃取5min，循環萃取兩次，萃取結束后用氮氣將萃取罐內的溶劑吹出。整個萃取過程耗時12min(研磨和萃取柱填裝時間不計)。后續采用免疫親和萃取，液相色譜光化學催化熒光檢測的方法進行分析，得到了良好的回收效果。

在線免疫親和凈化

采用免疫親和固相萃取的方法進行生物毒素的凈化是一種有效的前處理方法。此方法是利用抗體抗原的特異性反應，選擇性吸附生物毒素，去除干擾雜質。與傳統的凈化技術相比，免疫親和固相萃取具有以下特點：凈化效率更高;線性范圍更寬;減少有害溶劑的使用;簡化凈化步驟降低整體分析時間。但是固相萃取操作多數情況下需要人工操作，由于個人操作習慣以及實驗室之間使用設備的不同，可能降低分析重現性以及不同實驗室間的重現性。同時，大量的操作人員暴露時間也增加了對操作人員造成傷害的可能性。為解決這些問題，人們正在尋找一種方法，將免疫親和固相萃取技術和高效液相色譜柱后衍生熒光檢測技術進行聯機，以完全自動化地實現黃曲霉毒素的分析。

表1. 采用第一類全自動分析系統的數據統計

目前報道的這類全自動聯機黃曲霉毒素分析系統可以分為兩類，一類是在自動固相萃取系統上配備進樣閥作為液相色譜系統的進樣系統，另一類是將一個可以反復使用的免疫親和固相萃取柱連接到液相色譜的進樣系統上，自動實現萃取和進樣操作。

第一類全自動分析方法實質上是將傳統的手工操作實現了自動化，所以采用此類系統可以方便地將手工操作方法進行移植。同時，由于使用了全自動化的設備，減少了人為的操作，故可以有效提高分析效率，提高分析結果的重現性，并能保護操作人員。D.Chan 等人采用一個開放的全自動固相萃取平臺通過進樣閥與液相色譜系統聯機對7 種基質中的黃曲霉毒素(B1、B2、G1、G2)以及赭曲霉素A 進行分析，得到了良好的效果。

圖1. 在線免疫親和凈化柱連接示意圖。

Gerstel 公司采用其全自動固相萃取平臺與LC/MS 系統聯機對黃曲霉毒素(B1、B2、G1、G2)進行全自動分析。全自動固相萃取采用3 ml 免疫親和柱對樣品進行自動凈化，并在凈化后進行自動的柱后衍生以適應后續的質譜分析。此系統對四種黃曲霉毒素的檢出限達到0.01 μg/kg。對黃曲霉毒素G1 和B1進行12 次分析的RSD 分別為3.4% 和5.3%，回收率分別為89.5% 和90.3%。同時，采用此全自動系統減少了操作人員50% 的暴露時間，有效保護了操作人員的安全。

第二類全自動分析系統的核心是可以反復使用的穩定免疫親和固相萃取柱。因為此固相萃取柱有時會被切入高壓系統，故其還要能夠承受在較高壓力下工作。

趙孔祥等用自制的在線免疫親和柱搭建了一套在線免疫親和凈化- 液相色譜- 串聯質譜系統，用來測定中藥及中成藥中的多種真菌毒素，其基本結構如圖1 所示。

在線免疫親和凈化技術通過柱切換技術將在線凈化柱與分析柱串聯，目標化合物直接由凈化柱洗脫至分析柱，實現了凈化自動化。在線凈化分析主要包括4 步：上樣、轉移、分析測定和清洗平衡，其中分析測定與在線凈化柱清洗平衡可以同時進行。在轉移過程中，在線凈化柱與分析柱串聯使用，其他步驟中兩柱并聯使用。他們運用此系統對10種真菌毒素的定量限為1~5 μg/kg，回收率為62.3%~107.1%，相對標準偏差為2.1%~15%，基本滿足分析要求。遺憾的是此自制的免疫親和凈化柱對黃曲霉毒素吸附能力不足，未能實現對黃曲霉毒素的在線凈化。

圖2. 在線免疫親和固相萃取- 液相色譜連接圖集運行過程。

S.Jinap 采用一個商業化的可重復使用的免疫親和固相萃取柱(Venture AFIAC, Grace)構建了一套在線免疫親和凈化- 液相色譜系統, 來測定食品中的黃曲霉毒素，見圖2。系統由一個梯度泵(用于輸送洗脫液和流動相)，一個等度泵(用于輸送活化液)，一個自動進樣器，兩個自動六通閥，一個熒光檢測器組成。Venture AF 在線免疫親和凈化柱內裝以打孔硅膠為機體的免疫親和填料，此填料可以在0~3000 psi 條件下長期工作，可以連續使用多達200 次以上而性能不發生變化。

應用此系統對黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2 進行分析，色譜峰型較好，線性范圍較寬，線相關系數(R2)在0.999以上。其最小檢出限(LODs)分別可以達到0.32、0.16、0.20、0.14 ng/ g，最小定量限可以達到0.64、0.32、0.40、0.29 ng/ g。對于食品樣品進行加標實驗得到黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2 的回收率分別為75.7%~92.9%，7 2 . 1%~1 0 3 . 0%， 7 6 . 0%~1 0 7 . 9%，82.1%~103.3%。同時，還對此系統的日內和日間重現性進行了考察，完全符合相關標準對黃曲霉毒素分析的要求。

小結

從目前的文獻報道來看，很少有報道將提取、凈化以及分析實現聯機的系統。在當前的研究基礎上，如果能夠構建一種集萃取、凈化、分析于一體的全自動分析系統，對解決提高生物毒素分析效率，提高重現性，保護分析人員，降低測試成本將具有重要的意義。從上面的分析可見，最合理的方式是將壓力溶劑萃取(ASE)與在線免疫親和凈化-高效液相色譜進行聯機使用，通過系統的綜合控制，實現對固體樣品的一體化全自動分析。