藥物誘導細胞凋亡時bcl2表達變化

【原理】

逆轉錄-聚合酶鏈反應(ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction，RT-PCR)的原理是：提取組織或細胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo（dT）或隨機引物利用逆轉錄酶反轉錄成cDNA。再以cDNA為模板進行PCR擴增，而獲得目的基因或檢測基因表達。RT-PCR使RNA檢測的靈敏性提高了幾個數量級，使一些極為微量RNA樣品分析成為可能。該技術主要用于：分析基因的轉錄產物、獲取目的基因、合成cDNA探針、構建RNA高效轉錄系統。

【試劑與器材】

1.上游引物:5'-CTGGTGGACAACATCGCTCTG-3'

2.下游引物:5'-GGTCTGCTGACCTCACTTGTG-3'

3.OligdT150.1μmol/L

4.TRIzol試劑

5.M-MLV。

6.dNTP2.5mmol/L分別取等體積的10mol/L的dATP，dGTP，dTTP，dCTP四種混合即成

7.TaqDNA聚合酶（國產或進口）：濃度為5U/μl，50μl反應液中加1U。

8.消毒三蒸水

9.6×載樣buffer0.25%二甲苯青FF，0.25%溴酚藍，30%甘油

10.50×TAE電泳Buffer12.2gTris，2.85ml冰醋酸，10ml0.25mol/LEDTA(pH8.0)，加水至50ml。

11.溴化乙錠(EB)溶液10mg/ml(避光保存)，每100ml瓊脂糖凝膠加5μl貯存液，即凝膠中EB終濃度為0.5μg/ml，此試劑為強致癌物，要戴手套操作，避免污染環境。

12.DNAMarker
13.各種國產或進口移液器(10，20，100μl)

14.消毒的0.2mlPCR管，10μl，100μltips

15.離心機

16.PCR儀

17.水平電泳槽和電泳儀

18.紫外分析儀
【操作步驟】

1.總RNA的提取

將細胞以4.0×108/L密度接種于用12孔培養板中，每孔3mL，37℃、5%CO2孵箱中培養至細胞貼壁，加入長春新堿，使之終濃度分別為0、10、100μg/mL。繼續培養過夜。按Trizol試劑盒說明，在預期時間加入1mLTrizol試劑，置室溫5min，吸至1.5mL經DEPC水處理過的EP管中，置室溫5min，加氯仿0.2mL，振搖50s，置室溫5min，分層。4℃，11000×g離心15min。仔細取上層水相，移至另一EP管中，加0.5mL異丙醇，混勻。置室溫10min，4℃11000×g離心10min，用DEPC處理的75%乙醇洗滌沉淀(RNA)，4℃，7200×g離心5min，棄上清真空干燥后，沉淀溶解于20μL無RNase的水中，樣品保存于-20℃備用。RNA樣品用紫外分光光度儀測定A260和A280，計算含量。

2.逆轉錄

按下列步驟進行逆轉錄,合成cDNA第一鏈?總RNA5μL(2μg),

95℃,3min;加oligo(dT)2μL,70℃,5min,冰浴5min,離心?加5×M-MLVbuffer5μL?dNTP(每一種濃度為2.5mmol/L)5μL?M-MLV(200u/μL)1μL?

40U/μLRNase1μL?DEPC處理水6μL,總體積25μL,瞬間離心,混勻,

42℃水浴60min?合成的cDNA于4℃或-20℃保存備用?

3.PCR

取0.2mlPCR管，按下表操作：

用手指彈管壁混勻 ，稍離心，蓋蓋，編號。于PCR儀上進行PCR反應。PCRPCR反應參數為:熱啟動94℃，3min;94℃,30s,50℃,30s,72℃,50s,30個循環；72℃,3min。反應完成后，取10μL樣品在0.8%的瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下觀察，成像。