質粒的制備

在pH 12.0 ~ 12.6堿性環境中，細菌的線性大分子量染色體DNA變性分開，而共價閉環的質粒DNA雖然變性但仍處于拓撲纏繞狀態。將pH調至中性并有高鹽存在及低溫的條件下，大部分染色體DNA、大分子量的RNA和蛋白質在去污劑SDS的作用下形成沉淀，而質粒DNA仍然為可溶狀態。通過離心，可除去大部分細胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質，質粒DNA尚在上清中，然后用酚、氯仿抽提進一步純化質粒DNA。

大腸桿菌菌液

LA培養基 LB培養基 75%乙醇

搖床 離心機 超凈臺 TE

1.取含有pUC18質粒的大腸桿菌菌液于LA培養基上37℃過夜培養；

2.用無菌牙簽挑取單菌落，接種于含有Amp抗生素的LB培養基中，37℃搖床——250 r/min過夜培養；

3.吸取1.5 ml菌液，12000 g離心2分鐘，收集菌體，倒掉菌液；吸取1.5 ml菌液，再次收集菌體，盡量將菌液倒干凈；

4.加入300 ml溶液 I振蕩打勻，重新懸浮細胞，震蕩混勻（注意：應徹底打勻沉淀或碎塊）；

5.加入300 ml溶液II，輕柔顛倒混勻，放置至清亮，一般不超過5分鐘；

6.加入300 ml溶液III顛倒混勻，放置于冰上10分鐘，使雜質充分沉淀；

7.12000 g離心10分鐘；

8.吸取800 ml上清液（注意：不要吸取到飄浮的雜質）至另一Eppendorf管中，加入2/3體積的異丙醇，室溫下放置5分鐘；

9.12000 g 常溫離心15分鐘；

10.倒盡上清，加75%乙醇浸洗除鹽（放置片刻或離心3分鐘后倒去上清）；

11.室溫放置或超凈臺上風干DNA；

12.加40 ml滅菌超純水或TE溶解；

13.質粒、BAC的質量檢測，于-20℃保存。

小量制備的質粒DNA經酚/氯仿抽提后可以進行限制性內切酶分析 , 但是對于一些 DNA 純化要求高的實驗如哺乳動物細胞轉染、轉基因動物操作等， 需要進一步提高質粒DNA的純度。這種純度要求不但包括細菌染色體DNA 、RNA 及蛋白質的去除 ,而且還要選擇質粒 DNA 的不同分子構型，一般為純化共價閉環質粒 DNA 。常用方法如下：

①聚乙二醇沉淀法 ;

②氯化銫 -溴化乙錠密度梯度離心法：多年來仍是提供毫克級高純度質粒 DNA的基本方法， 該方法需要使用溴化乙錠和較長時間超速離心 ,它能制備大量質粒 DNA ,但比較昂貴和費時 ;

③Sepharose C L-4B 和 Bio-Gel A-150 m 層析法 ;

④NaCl 超速離心法 。

附注：質粒檢測

電泳檢測：質粒電泳一般有三條帶，分別為質粒的超螺旋、開環、線型三種構型

吸光值檢測：采用分光光度計檢測260nm、280nm波長吸光值，若吸光值260nm/280nm的比值介于1.7－1.9之間，說明質粒質量較好，1.8為最佳，低于1.8說明有蛋白質污染，大于1.8說明有RNA污染。

來源于《質粒的制備》安徽醫科大學學報。