質粒DNA大量制備實驗—

發布時間：2019-03-26 14:35 原文鏈接：質粒DNA大量制備實驗——堿裂解法

用堿和SDS處理可以大規模的細菌培養物中分離質粒DNA，所獲得的質粒則可通過柱層析或CsCl- 溴化乙錠梯度離心進一步純化。了解質粒的特性及其在分子生物學研究中的作用；掌握質粒DNA分離和純化的原理；學習堿裂解法和煮沸法分離質粒DNA的方法。

實驗方法原理	這一方案科能是最常用的質粒制備方法，該法不僅相當決捷可靠，而且可獲得相當純凈的粗制DNA。
實驗材料	大腸桿菌
試劑、試劑盒	葡萄糖 Tris EDTA TE NaOH SDS 異丙醇乙醇乙酸甲
儀器、耗材	離心機漩渦混合器水浴鍋
實驗步驟	1. 往2 ml 燒瓶中加入500 ml ，含有適當抗生素的LB培養基，然后加入5 ml 過夜培養的。 2. 帶有所需質粒的大腸桿菌培養物，再于37℃培養至飽和狀態（OD₆₀₀≈4）。 3. 于4℃，6 000 g 離心10 min，用4 ml GTE。 4. 溶液重懸沉淀，并轉移到一個容積≥20 ml 的高速離心管中。（細菌沉淀可以在-20℃或-70℃無限期保存。） 5. 加入1 ml 新配的含25 mg/ml 溶菌酶的GTE溶液，重懸沉淀，于室溫放置10 min。 6. 加入10 ml 新配的NaOH/SDS溶液，并且輕輕混勻直至液體變得均一、清亮而粘稠。于冰上放置10 min。 7. 加入7.5 ml 乙酸鉀溶液，用吸管輕輕攪拌直至粘稠度下降并形成大的沉淀，于冰上放置 10 min。 8. 于4℃，20 000 g 離心10 min 將上清輕輕倒入至另一個干凈的離心管中，如果有可見的飄浮物可用數層紗布過濾。 9. 加入0.6倍體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫放置5~10 min。 10. 于室溫1500 g 離心10 min。 11. 加入2 ml 70%乙酵輕輕洗滌沉淀，然后短暫快速離心，吸去乙醇，并真空干燥。 12. 沉淀可以在4℃無限期保存。

儀器