| 實驗步驟 | 1.從標記細胞提取ATP
1) 備下列材料：
本實驗用到的所有溶液必須用Mlli - Q純化的水或它的等價物配制。
冰冷的4%高氣酺（v/v)
三-n-辛胺
1,1,2-三氮三m乙烷
32p標記的細胞
帶螺帽的聚丙烯離心管
測量范圍PH4~8的PH試紙
小心：高氣酸■ 三-n -辛胺； U 1，2-三氯三氟乙燒；放射性物質（見附錄5)2) 從標記細胞中吸出培養基，用PBS清洗兩次。徹底吸去清洗液，將細胞放入冰盒。
迅速加入〇.5ml冰冷的4%高氯酸，輕輕混勻以裂解細胞，冰浴5分鐘s將細胞到入酸液，定量轉移至一個帶螺帽的離心管。于4尤全速離心5 分鐘以沉淀細胞碎片。3) 將上清轉移至新的離心管，放入冰浴。按 1.2比1的比例新鮮配制三- n -辛胺與1,】，2_三氯三氟乙烷的混合物，混勻。加0.6ml混合物到高氯酸樣品，蓋緊螺帽，用旋渦混合器振蕩1分鐘以上。
此時一定要充分混勻，以確保完全中和。
4 ) 完全混勻后，室溫離心5分鐘Q
離心后溶液明顯地分成三層。底y是過屆:的二-n -辛咹/I, I，2--:氣二氟乙烷，屮M是高氯酸辛胺（這 -層通常呈黃色），1：層水相是己中和的樣品。
5) 吸出上層到新離心管，用PH試紙測pH值。pH值應是PH6~73如果樣品f_H值低于6,則重復用-:-n-卡胺/I，丨，2 三氣三婕乙烷處理；這種情況很少見。
此時樣品句以進行分析了 管用什么方法，都要有已知A1P濃度的標準樣品與測試樣品平行用二- ? -辛胺< 24J ■ /U〖，2_—氣三M己坑提取。
2.從細胞裂解物中提取ATP
從細胞裂解物中提取ATP，按上述方法做以下修改即可。
1) 準備下列材料：
標記的細胞裂解物
冰冷的8%高氯酸（v/v)
-辛胺
1，1，2_三氯三氟乙烷
帶密封蓋子的5-ml聚丙烯離心管
2) 在一個5-ml聚丙烯離心管里，往裂解物中加等量的冰冷的8%高氯酸，放于冰上。
徹底混勻，冰浴5分鐘D于4^：離心5分鐘或者直至蛋白質完仝沉淀。將 h清吸出到一個新離心管，按上述基本方法屮和53) 蛋白質沉淀后的樣品中加1.2倍體積三-re-辛胺/I,2_三氯三氟乙烷，用旋渦混合器充分振蕩。然后完全按上述基本方法繼續實驗。 展開 |
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