透析得可溶的重折疊σ32單體實驗

Tris NaCl

CentriconTM-10 型離心濃縮器 大小排阻髙效液相色譜柱

材料與設備

Centricon^TM-10 型離心濃縮器（Amicon，Inc.)

大小排阻髙效液相色譜柱 TSK-GEL G3000 PWXL(7.8x300 mm)(TosoHaas)

50 mmol/L Tris(pH7.9)+200 mmol/LNaCl

操作程序

用大小排阻 HPLC 色譜檢測可溶性單體的形成

1）在擬試的條件下透析樣品。

2）從透析袋中取出樣品，13000r/min 離心 10 min, 使澄清。保留上清。

3) 若透析時樣品的蛋白濃度太低，則可用 Cenricon-10 型離心濃縮器濃縮。于 Centricon-10 管中加 2.0 ml 透析樣品，13000r/min 離心 90 min, 或至體積減至原體積的 1/5~1/10。
注：需要選擇某一孔徑大小的 Centricon 管，以使水和鹽能在離心力作用下透過膜而把σ³² 保留下來。Centricon-30 和 Centrioon-100 管的孔徑較大，濃縮也較快，但本實驗采用 Centricon-10 管，其標稱截留分子量為 10000Da, 這是因為σ³² 的分子量是 32000Da 而有些σ³² 會通過較大的孔透出。Centricon 管也可用來改變樣品的鹽濃度。可簡單地將樣品濃縮 10 倍，再用另一種緩沖液將其恢復至原體積。能處理更小（0.5 ml;Micrecon 型）和更大（20 ml;Centriprep 型）體積的濃縮器也均可從 Amicon 公司買到。

4) 給大小排阻色譜柱 TSK-GELG3000PWXL(7.8x300 mm) 進樣 100~400ul 上清，該柱事先用 50 mmol/L Tris(pH7.9)+200 mmol/LNaCl 在 1 ml/min 流速下平衡，并在相同條件下洗脫，分部收集 0.5-ml 組分，計 30 min。
注：加鹽是為了防止蛋白質與聚合物基質的弱離子結合，這種結合作用會使洗脫時間失真，妨礙大小排阻色譜分析正常進行。

5) 用紫外檢測器于 280mn 檢測柱的流出液，估算作為可溶性單體而流出的物料的比例。
注：應先標定 HPIX 的大小排阻色譜柱，方法是用一組已知分子量的蛋白質在相同洗脫條件下過柱分析。再以分子量標準參照物的出峰時間對其分子量的對數作圖，用插入法即可求出分析σ³² 透析樣品時所洗聯的那種蛋白質的分子量。

6) 如必要，用 SDS-PAGE 電泳分析所選的組分，以證實洗脫峰的一致性。